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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. 皮下注射用抗原制备
- 在化学通风橱内执行本节中的所有程序，以防止吸入或皮肤接触结核分枝杆菌 （Mtb） H37Ra 粉末。根据您的机构政策处理 Complete Freund's Adjuvant（通常为 BSL-1）。这包括使用耐化学手套、安全眼镜和防护工作服（实验室外套）。
- 使用良好的无菌技术，以防止将引入实验动物的试剂受到污染。
- 通过在 5 mL 微量离心管中混合 5 mg 冻干、热灭活的结核分枝杆菌 H37Ra 粉末与 2.5 mL 冷 PBS ，在 PBS 中制备 Mtb 悬浮液。涡旋一次 30 秒，然后放在冰上。
- 要在 PBS 中生成 H37Ra 的精细悬浮液，请在冰上对悬浮液进行超声处理 5 分钟。
- 松开转换器单元的主体，并用 70% （v/v） 酒精棉签清洁探头。
- 打开超声仪，通过转动电源控制旋钮将功率设置调整为 4，然后将探头尖端浸入含 PBS 的分枝杆菌粉末中。确保探针尖端浸入样品深度的至少一半，并且探针尖端没有接触微量离心管的壁。
- 在冰上对混合物进行超声处理 30 秒，暂停 30 秒，然后重复总共 5 分钟，以将粉末完全分散成均匀的悬浮液，而无需加热液体。
- 向混合物中加入 2.5 mL Freund's Infully Adjuvant，并在冰上重复超声处理过程，直到乳液形成牙膏般的稠度。
- 使用控制旋钮将功率设置为 0 并关闭设备以结束超声处理。从悬浮液中取出尖端，然后用酒精棉签擦拭探头。
- 将抗原乳液储存在4°C。分批生产乳液将有助于确保实验之间的一致性。乳液可在 4 °C 下储存长达 3 个月。
2. 皮下注射
玻璃- 体内注射前一周（指定为第 -7 天）进行皮下注射。
- 在 1 mL 注射器（未连接针头）中加入分枝杆菌乳剂。由于乳液的粘度和不透明性，难以看到的气泡会充满注射器。
- 为防止注射器中出现气泡，在装入 0.2-0.3 mL 乳剂后，倒置注射器（尖端朝上）并在计数器边缘轻轻敲击注射器，使气泡浮出水面。
- 排出注射器中的空气并继续填充注射器。倒置并间歇性敲击直至填满。
- 将 25 G 针头放在注射器上，并推进乳剂以填充针头。将注射器存放在冰上直至使用。
- 为了安全地进行皮下注射，要么麻醉老鼠，要么使用人道的约束方法，以便轻松进入动物的后躯。
- 为了麻醉皮下注射，将动物置于异氟醚诱导室中（诱导为 3%-4%，维持为 1%-3%）。麻醉后，确保小鼠的呼吸频率缓慢且没有呼吸窘迫的迹象。
- 将皮下注射剂放在臀部的背侧或靠近腹股沟淋巴结区域的腿部腹侧表面。
- 小心插入针头，以防止注射到肌肉中。将 0.05 mL 的 Mtb 乳剂注入皮下空间。不要立即取下针头，以便让浓稠的乳液完全注入。
- 在左侧和右侧重复注射，每只动物总共 0.1 mL。
- 如果麻醉，请将鼠标放在温暖的加热垫上，直到完全恢复。在鼠标恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。
- 完全恢复后将鼠标放回笼子里，并在笼卡上贴上皮下注射日期。
- 口服对乙酰氨基酚（200 mg/kg/天）提供镇痛，但不使用非甾体抗炎药，因为抗炎药会影响葡萄膜炎的诱导。
3. 玻璃体内注射的抗原原液制备
- 在适当的无菌条件下执行本节中的所有程序，以防止玻璃体内 Mtb 悬浮液受到污染。
- 制作玻璃体内悬浮液。
- 为了诱导轻度至中度全葡萄膜炎，通过将 5 mg 分枝杆菌提取物添加到 1 mL 1x PBS 中，制成浓度为 5 mg/mL 的玻璃体内悬浮液。
- 为了诱导中度至重度全葡萄膜炎，通过将 10 mg 分枝杆菌提取物添加到 1 mL 1x PBS 中，制备浓度为 10 mg/mL 的玻璃体内悬浮液。
- 涡旋一次 30 秒，然后放在冰上。
- 为了在 PBS 中生成 H37Ra 的精细悬浮液，请按照步骤 1.4 中的说明在冰上对悬浮液进行超声处理 10 分钟。以 100 μL 体积分装该储备液并储存在 -20 °C。
- 使用前，在室温下解冻并高速涡旋 1 分钟。将等分试样运输到动物设施时，将等分试样保存在冰上。
4. 第 0 天的玻璃体内注射程序
- 动物准备
- 戴上合适的检查手套，将鼠标放在称重天平上，以获得其重量（以克为单位）。
- 腹膜内注射 0.02 mL/g 体重的含有 100 mg/mL 氯胺酮和 20 mg/mL 甲苯噻嗪与无菌水混合的溶液，以麻醉动物。另一种方法包括使用 ~1.5% 异氟醚（吸入）诱导。
- 等待大约 2 分钟让鼠标进入睡眠状态，然后将鼠标放入保温箱中并盖上盖子。进行疼痛反射测试，如捏耳、脚趾和尾巴，以评估手术的麻醉深度。
- 入睡后，用 1 滴 0.5% （v/v） 丁卡因麻醉角膜。避免在小鼠的鼻子或嘴巴附近使用丁卡因。10 秒后，轻拍掉多余的液体。
注意： 据观察，当进行局部麻醉时，虹膜扩张和前房 （AC） 可视化得到改善，这可能是由于全身麻醉和局部麻醉联合改善了角膜反射抑制。但是，如果需要，可以省略此步骤。
- 用 1 滴 2.5% （v/v） 去氧肾上腺素扩张瞳孔。小心避免任何多余的飞沫进入鼻子或嘴巴。2-3 分钟后，轻拍掉多余的液体。
- 为了降低患眼内炎的风险，在眼表和周围的头发中加入 1 滴 5% 的优碘。留在眼睛上 2-3 分钟。
注意：在适当的无菌条件下执行本节中的所有程序，以预防眼内炎。
- 去除优碘并用羟丙甲纤维素 （0.3%） 或卡波姆眼凝胶 0.2% w/w） 覆盖眼睛，以防止麻醉下干燥。这也将有助于防止白内障的形成。
- 设置显微注射系统
- 使用连接到微型注射器泵控制器和注射注射器的微型泵进行玻璃体内注射（图 1A-C）。或者，按照第 4.4 小节所述，使用连接到 Hamilton 注射器的 33 G 针头注射。
- 将 34 G 针头连接到进样架以组装进样器。松开进样支架前端的银色螺帽，将针头滑入支架主体约一半。用手拧紧银色螺帽。
- 按照步骤 4.2.4-4.2.5 中的说明将管路连接到进样支架。
- 要将管路插入进样架上，请松开管路固定架后端的塑料螺钉，将管路滑过内部垫圈，然后拧紧螺钉。
- 与管路末端保持轻微的间隙，以防止在注射过程中损坏管路。请参阅图 1C。
- 解冻 100 μL 分枝杆菌原液悬浮液。
- 加入 3 μL 的 1% 荧光素钠 （AK-Fluor） 溶液并充分涡旋。
- 在 10 μL 注射器中加入抗原和荧光素混合物，不含任何气泡。
- 从注射器中取出加载针，将管路滑过银色螺帽垫圈，直到尖端到达注射器主体上的零标记。
- 将管子尖端正确对齐到所需位置后，用手拧紧螺帽。
- 通过进样管冲洗注射器中的溶液，使系统完全加载。然后重复步骤 4.2.8-4.2.11 以重新加载注射器进行注射。
- 要将加载的注射器安装在微型泵上，请按下微型泵末端的夹具释放按钮以打开注射器夹具。
- 将柱塞盖放入微型泵后端的柱塞盖支架中。
- 然后将注射器套环滑到套环挡块上，将注射器主体滑入注射器夹中。
- 松开 clamp 按钮并拧紧柱塞固定螺钉。请参阅图 1D。
- 将注射支架和针头滑过立体定向注射装置上的 O 形夹。这是一个自定义平台;或者，可以手动握住和定位注射器。
- 在微型注射泵控制器上设置输注量和输注量速率，以 40 nL/s 的速率每个周期注入 500 nL><。
注意：可以使用更快的注射速度，但是，在实现针头重新定位之前，可能会经历更多的反流。
- 在进行玻璃体内注射之前，请测试系统以确保功能正常。
注意：当注射系统正常工作时，使用脚踏板或控制板激活注射循环将导致柱塞盖支架的可见移动，并且在针尖处会看到一小滴绿色液体。如果未产生液体，则激活其他循环或冲洗并重新装入注射器。
- 在注射眼睛之前，用 95% 乙醇垫轻轻擦拭针头。
- 玻璃体内注射程序
- 将鼠标放在立体定位装置上以执行注射程序。
- 通过在鼠标表面贴上 2-3 张纸巾，保持鼠标所在的舞台/平台温暖。
- 将鼠标置于平台上的俯卧位置。使用左右耳杆轻轻固定动物的头部。请参阅图 1E。
- 放置鼠标并将其定向在内窥镜下，以便可以看到右眼的上鼻部。
- 使用 30 G 针头移位睫毛并露出巩膜。可视化角膜缘和桡状血管。
- 使用无菌的 30 G 针头在角膜缘后 1-2 毫米的巩膜上打一个导向孔。
- 将连接到注射支架的 34 G 针头通过导向孔以避开晶状体的角度插入眼睛，但将针尖放入玻璃体腔中。
- 使用微型注射泵控制器，小心地将 1 μL 的 Mtb 提取物注入玻璃体腔。如果持续回流，将进样量增加到 1.5 μL，以确保足够的剂量输送><。
注意：对于假对照，将 1 μL PBS 注入动物的眼睛中。
- 通过可视化眼睛中的绿色反射来验证玻璃体内放置。请参阅图 1F。
- 10 秒后，将针头从眼睛中取出。注意任何反流。
- 从平台上取下鼠标，将 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆眼膏涂抹在双眼上以保护角膜，然后移至恢复加热箱。
- 在鼠标恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。在完全康复之前，不要返回其他动物的陪伴。
- 当小鼠完全清醒时，回到笼子中并加入对乙酰氨基酚 （200-300 mg/kg/天） 药水瓶。在笼卡上贴上 IVT 注射日期的标签。
- 玻璃体内注射通常耐受性良好。可能表明疼痛和需要从研究中移除的临床体征包括眼周脱发（表明自我创伤）、角膜溃疡、体重减轻和驼背姿势。
- 玻璃体内注射的替代方法
注意： 该程序是使用手术显微镜和微量注射器上的 33 G 针头进行的。
- 将眼睛倾斜并用一对镊子将其固定到位。
- 然后涂抹 0.2% w/w 或 0.3% 羟丙甲纤维素眼凝胶的卡波姆眼凝胶，并将圆形盖玻片（直径 7 毫米）放在眼睛上。
- 将 33 G 皮下注射针头安装在 5 μL Hamilton 注射器上，并以 ~45° 的注射角度将其插入角膜缘圆周约 2 毫米处。
- 将针斜面引导到玻璃体中，停在晶状体和视盘之间（从外科医生的相对角度来看，这是在视盘上方/覆盖视盘 - 距插入部位约 1.5 毫米），然后缓慢注入 2 μL Mtb（PBS 中 2.5 ug/μL）。
- 将针头短暂固定到位（以减少注射液的反流量），然后将其取出。
- 注射后，通过释放镊子来重新定位眼球。此时可以将 1% w/w 氯霉素软膏滴入眼睛，以提供额外的保护，防止注射后眼内炎。
- 注射后，如步骤 4.3.11-4.3.13 中所述移至恢复加热箱。
5. OCT 成像检测和量化葡萄膜炎
- 动物准备
- 按照步骤 4.1.2-4.1.4 中的说明麻醉鼠标
- 用 1 滴 2.5% 去氧肾上腺素扩张瞳孔。小心避免任何多余的飞沫进入鼻子或嘴巴。2-3 分钟后，轻拍掉多余的液体。
- 将 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆凝胶放在眼睛上，以防止麻醉时干燥。这也将有助于防止白内障的形成。
将- 鼠标包裹在一层手术纱布中以保持身体温暖，并将其放在动物盒上。用咬杆定位头部。
- 获取前房和后房的 OCT 图像。
注意：如果获取前房和后房图像，请先获取后房 （PC） 图像，以防止白内障形成后图像质量下降。通过频繁润滑和涂抹 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆眼凝胶，可以防止白内障的形成。对于扩展成像（>10 分钟），保持鼠标温暖（通过使用加热垫）也有帮助。
- 打开 OCT 成像系统后，固定正确的成像镜头并根据需要调整参考臂位置。
- 打开成像软件，创建唯一的鼠标 ID，然后根据 OCT 制造商的协议开始成像。
- 使用快速扫描方案的 Free Run 选项，将眼睛置于视神经的中心，以后房图像为中心，或将角膜顶点置于前房图像上。
注：表 1 包含两种市售小动物成像系统的成像协议参数。有关产品规格，请参阅材料表。
- 对于后房成像，将 OCT 靠近眼睛表面。请小心避免镜头表面接触眼睛。
- 眼睛正确定位后，停止快速扫描，选择体积扫描协议，然后使用 Aim 选项激活扫描。
- 对于后段图像，进行调整，直到视神经在水平 B 扫描对齐图像中居中，并且视网膜与垂直对齐轴对齐
- 对于眼前节图像，在水平 B 扫描对齐图像和垂直对齐 B 扫描对齐图像中调整位置以使角膜顶点居中。两张图像中都存在反射伪影将确认正确对齐。然后，将水平图像移动到足以去除反射伪影的程度。请参阅图 2。
- 单击 Snapshot 以捕获卷扫描映像，然后单击 Save 。
- 接下来，获取平均中心线扫描。打开扫描协议并单击 Aim 后跟 Snapshot。右键单击同一面板，然后单击 Average。
- 对具有两个镜头的每只眼睛重复步骤 5.2.1-5.2.9。
- 收集完所有图像后，从暗盒中取出鼠标，并在恢复过程中提供角膜保护，如步骤 4.3.11-4.3.13 所示。
6. 通过 OCT 对炎症进行评分
- 在对处理条件不知情的分级员的帮助下对 OCT 图像进行评分。
注意：对于小鼠模型中的 PMU，建议使用表 2 中提供的评分系统。
- 如果同时获得了前房 （AC） 和后房 （PC） 图像，请将这些分数合并以获得每只眼睛的最终分数。
注意：前房炎症在后房炎症之前消退。
表 1：扫描参数。（A） OCT 扫描参数。（B） 眼底/视网膜 OCT 扫描参数
<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always">
一个
小鼠前房
快速扫描
卷扫描
线性扫描
长 X 宽
4.0 毫米 x 4.0 毫米
3.6 毫米 x 3.6 毫米
3.6 毫米
角度
0
90
90
A 扫描/B 扫描
800 元
1000
1000
# B 扫描
50
400
1
框架/ B扫描
1
3
20
小鼠后房
快速扫描
卷扫描
线性扫描
长 X 宽
1.6 毫米 x 1.6 毫米
1.6 毫米 x 1.6 毫米
1.6 毫米
角度
0
0
0
A 扫描/B 扫描
800 元
1000
1000
# B 扫描
50
200 元
1
框架/ B扫描
1
3
20
乙
小鼠后房
卷扫描
线性扫描
长 X 宽
0.9 毫米 x 0.9 毫米
1.8 毫米
角度
0
任意（通常为 0 或 90）
A 扫描/B 扫描
1024 元
1024 元
# B 扫描
512 元
1
框架/ B扫描
1
30
表 2：PMU OCT 评分标准：OCT 图像根据表中列出的标准进行评分。将 AC 和 PC 分数相加以获得眼睛的最终分数。在没有获得清晰眼睛视野的情况下，为图像分配 NA 评分，这些图像被排除在研究之外。
<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always">
OCT 分数说明
得分
前房
后房
那
前角膜以外的视野
无眼后节视图
0
无炎症
无炎症
0.5
1-5 个细胞在水性溶液中
少数细胞占据玻璃体面积不到 10%
OR 角膜水肿
无视网膜下或视网膜内浸润或视网膜结构破坏
1
6-20 个水细胞
弥漫性细胞（无致密团块）占据玻璃体面积的 10% 至 50%。
或晶状体前囊上的单层细胞
无视网膜下或视网膜内浸润或视网膜结构破坏
2
20-100 个细胞在水性溶液中
弥漫性细胞（无致密团块）占据玻璃体面积的 50% >
或少于 20 个细胞且存在前房积脓
无视网膜下或视网膜内浸润或视网膜结构破坏
3
20-100 个细胞在水性溶液中
弥漫性细胞等于 2 级和 1 级
和前房积脓或瞳孔膜
并且至少一个致密的玻璃体混浊占据玻璃体面积的 10%-20%，或者存在相当于 2 级和罕见 （≤ 2） 的玻璃体细胞视网膜下或视网膜内混浊
4
任意数量的水性细胞
致密的玻璃体混浊占据>玻璃体面积的 20%。
和大的前房积脓和瞳孔膜或由于严重炎症导致前结构丧失
或弥漫性玻璃体细胞，伴有较大的视网膜下或视网膜内混浊
