用于评估小鼠模型中葡萄膜炎的光学相干断层扫描成像

摘要

来源：John, S. 等，Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. 用于研究感染后葡萄膜炎的致敏分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）模型。 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了一种用于检测和量化感染后葡萄膜炎小鼠模型中眼部炎症的体内成像技术。该技术称为光学相干断层扫描（OCT），可生成眼部的高分辨率横断面图像，用于评估疾病进展。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 皮下注射用抗原的制备

1. 在化学通风橱内进行本节中的所有操作，以避免吸入或皮肤接触结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）H37Ra 干粉。根据您所在机构对完全弗氏佐剂（通常为生物安全等级1，BSL-1）的管理规定进行操作，包括使用耐化学腐蚀的手套、安全护目镜和防护工作服（实验外套）。
2. 采用良好的无菌技术，防止引入实验动物体内的试剂受到污染。
3. 在5 mL 微量离心管中，将5 mg 冻干、热灭活的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）H37Ra 干粉与2.5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）混合，制备Mtb 悬液。涡旋振荡30秒后置于冰上。
4. 为在PBS中形成H37Ra的细小悬液，将悬液置于冰上超声处理5分钟。
   1. 松开转换器单元的主体，用70%（v/v）乙醇棉片清洁探头。
   2. 开启超声仪，通过旋转功率控制旋钮将功率调节至4档，将探头尖端浸入含有分枝杆菌干粉的PBS中。确保探头尖端至少浸入样品深度的一半，且探头尖端不接触微量离心管管壁。
5. 在冰上对混合物超声30秒，暂停30秒，重复操作，总时长为5分钟，以充分分散粉末形成均匀悬液，同时避免液体过热。
6. 向混合物中加入2.5 mL 弗氏不完全佐剂，并在冰上重复超声处理，直至乳化液呈现类似牙膏的稠度。
7. 使用控制旋钮将功率调至0，关闭仪器以结束超声。将探头从悬液中取出，并用乙醇棉片擦拭探头。
8. 将抗原乳化液在4 °C下保存。制备成批的乳化液有助于确保实验间的一致性。该乳化液可在4 °C下保存长达3个月。

2. 皮下注射

1. 在玻璃体内注射前一周进行皮下注射（记为第 -7 天）。
2. 用 1 mL 注射器（不带针头）吸取分枝杆菌乳剂。由于乳剂具有黏稠性和不透明性，注射器中可能混入难以察觉的气泡。
   1. 为防止注射器中产生气泡，在吸入 0.2–0.3 mL 乳剂后，将注射器倒置（针头朝上），并轻轻反复敲击台面边缘，使气泡上升至表面。
3. 排出注射器中的空气，并继续加满乳剂。在填充过程中反复倒置并间歇性轻敲，直至完全充满。
4. 将 25 G 针头安装到注射器上，并推动乳剂使其充满针头。使用前将注射器置于冰上保存。
5. 为安全实施皮下注射，可对小鼠进行麻醉，或采用人道的固定方法，以便于接触动物的后肢区域。
6. 若需麻醉以进行皮下注射，将动物置于异氟烷诱导舱中（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–3%）。麻醉成功后，应确保小鼠呼吸频率缓慢，且无呼吸困难迹象。
7. 将皮下注射部位选择在髋部背侧或腹股沟淋巴结区域附近的腿部腹侧。
   1. 小心插入针头，避免将乳剂注入肌肉组织。向皮下间隙注射 0.05 mL 结核分枝杆菌（Mtb）乳剂。由于乳剂较黏稠，注射后不要立即拔出针头，以确保乳剂完全注入。
   2. 在左右两侧分别重复注射，每只动物总注射量为 0.1 mL。
8. 若已麻醉，将小鼠置于温热的加热垫上直至完全恢复意识。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
9. 小鼠完全恢复后将其放回笼中，并在笼卡上标注皮下注射的日期。
10. 给予口服对乙酰氨基酚镇痛（200 mg/kg/天），但避免使用非甾体抗炎药（NSAIDs），因为抗炎药物可能影响葡萄膜炎的诱导。

3. 玻璃体内注射用抗原储备液的制备

1. 在本节所有操作过程中，均需在适当的无菌条件下进行，以防止眼内注射用结核分枝杆菌悬液受到污染。
2. 制备眼内注射用悬液。
   1. 为诱导轻度至中度全葡萄膜炎，将5 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为5 mg/mL的眼内注射用悬液。
   2. 为诱导中度至重度全葡萄膜炎，将10 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为10 mg/mL的眼内注射用悬液。
3. 涡旋振荡30秒一次，然后置于冰上。
4. 为在PBS中形成H37Ra的细小悬液，按照步骤1.4所述方法，在冰上超声处理10分钟。将该原液分装为每份100 µL，于-20 °C保存。
5. 使用前于室温下解冻，并在高速下涡旋振荡1分钟。运输至动物实验设施过程中，始终保持分装样品处于冰上。

第0天玻璃体内注射操作步骤

1. 动物准备
   1. 佩戴合身的检查手套，将小鼠置于电子天平上，测量其体重（单位：克）。
   2. 按每克体重0.02 mL的剂量，向小鼠腹腔注射含有100 mg/mL氯胺酮和20 mg/mL赛拉嗪并用无菌水稀释的混合溶液，以进行麻醉。替代方法包括使用约1.5%异氟烷进行吸入诱导麻醉。
   3. 等待约2分钟，待小鼠进入睡眠状态后，将其放入保温箱中，并盖上盖子。通过耳部、脚趾和尾部夹捏等疼痛反射测试，评估麻醉深度。
   4. 小鼠入睡后，在角膜上滴加1滴0.5%（v/v）丁卡因进行局部麻醉。注意避免丁卡因接触小鼠鼻部或口部。10秒后，用棉签吸除多余液体。
      注意：观察发现，使用表面麻醉剂可改善虹膜扩张和前房（AC）的可视化效果，这可能是由于全身麻醉联合局部麻醉更有效地抑制了角膜反射。但如实验需要，此步骤可省略。
   5. 滴加1滴2.5%（v/v）去氧肾上腺素以扩大瞳孔。操作时需小心，避免多余药液流入鼻腔或口腔。2-3分钟后，用棉签吸除多余液体。
   6. 为降低眼内炎风险，在眼球表面及周围毛发处滴加1滴5%聚维酮碘。保持作用2-3分钟。
      注意：本节所有操作均应在适当的无菌条件下进行，以预防眼内炎。
   7. 清除聚维酮碘后，使用羟丙甲纤维素（0.3%）或卡波姆眼用凝胶（0.2% w/w）覆盖眼球，防止麻醉期间角膜干燥。此措施也有助于预防白内障形成。
2. 微注射系统的设置
   1. 使用连接至微注射泵控制器和注射器的微量泵进行玻璃体内注射（图1A-C）。或者，也可使用连接至Hamilton注射器的33 G针头，具体操作见第4.4小节。
   2. 将34 G针头连接至注射支架上以组装注射装置。松开注射支架前端的银色螺帽，将针头插入支架体内约一半深度，然后用手拧紧银色螺帽。
   3. 按照步骤4.2.4-4.2.5所述，将管路连接至注射支架。
   4. 为将管路插入注射支架，需松开支架后端的塑料螺钉，将管路穿过内部垫圈，再拧紧螺钉。
   5. 保持管路末端与针尖之间留有微小间隙，以防止注射过程中管路受损。参见图1C。
   6. 解冻100 µL分装的分枝杆菌储备悬液。
   7. 加入3 µL的1%荧光素钠（AK-Fluor）溶液，并充分涡旋混匀。
   8. 用10 µL注射器吸取抗原与荧光素混合液，确保无气泡。
   9. 取下装样针头，将管路通过银色螺帽垫圈缓慢推进，直至管路尖端到达注射器筒体上的零刻度线位置。
   10. 当管路尖端准确对齐至所需位置后，用手拧紧螺帽。
   11. 推动注射器内液体，使溶液流经注射管路，以完全填充系统。随后重复步骤4.2.8-4.2.11，重新装填注射器以备注射使用。
   12. 将已装填的注射器安装至微量泵上时，按下微量泵末端的夹钳释放按钮，打开注射器夹钳。
   13. 将推杆帽插入微量泵后端的推杆帽固定槽中。
   14. 然后将注射器卡环滑入卡环止位处，同时将注射器主体插入注射器夹钳中。
   15. 松开夹钳按钮，并拧紧推杆固定螺钉。参见图1D。
   16. 将注射支架及针头穿过立体定位注射装置上的O型夹。该装置为定制平台；也可手动持握并定位注射器。
   17. 在微注射泵控制器上设定输注体积和输注速率，分别为每个循环注射500 nL，速率为40 nL/s。
       注意：可采用更快的注射速率，但在针头重新定位前可能出现更多反流现象。
   18. 在进行玻璃体内注射前，测试系统以确保其正常工作。
       注意：当注射系统正常运行时，踩下脚踏开关或按下控制面板按钮启动注射循环，应能观察到推杆帽固定槽的明显移动，并在针尖处出现一小滴绿色液体。若无液体排出，可启动额外循环，或冲洗并重新装填注射器。
   19. 在对眼球注射前，用95%乙醇棉片轻轻擦拭针头。
3. 玻璃体内注射操作流程
   1. 将小鼠置于立体定位仪上，以执行注射操作。
   2. 通过在平台表面覆盖2-3层纸巾，保持小鼠所处台面温暖。
   3. 将小鼠俯卧于平台上，使用左右耳杆轻柔固定其头部。参见图1E。
   4. 调整小鼠位置，使其处于显微镜视野下，确保右眼鼻上方区域清晰可见。
   5. 使用30 G针头拨开睫毛，暴露巩膜。观察角膜缘及放射状血管。
   6. 使用无菌30 G针头在角膜缘后方1-2 mm处的巩膜上制作引导孔。
   7. 将连接于注射支架的34 G针头经引导孔以一定角度插入眼内，避免损伤晶状体，同时确保针尖进入玻璃体腔。
   8. 通过微注射泵控制器，小心地将1 µL结核分枝杆菌（Mtb）提取物注入玻璃体腔。若持续出现反流，可将注射量增至1.5 µL，以确保足量递送。
      注意：对于假手术对照组，向动物眼内注射1 µL PBS。
   9. 通过观察眼球内是否出现绿色反光，确认注射针头位于玻璃体内。参见图1F。
   10. 10秒后，将针头从眼内缓慢拔出。记录是否有反流现象。
   11. 将小鼠从平台上取下，在双眼涂抹0.3%羟丙甲纤维素或0.2% w/w卡波姆眼膏以保护角膜，并转移至恢复用保温箱中。
   12. 在小鼠恢复至能够自主维持胸卧位意识状态前，不得离开看护。在完全恢复前，不得与其他动物合笼。
   13. 当小鼠完全清醒后，将其放回笼中，并提供含乙酰氨基酚（200-300 mg/kg/天）的饮用水。在笼卡上标注玻璃体内注射的日期。
   14. 玻璃体内注射通常耐受性良好。可能提示疼痛并需终止实验的临床体征包括眶周脱毛（提示自残行为）、角膜溃疡、体重下降和弓背姿势。
4. 玻璃体内注射的替代方法
   注意：本操作使用手术显微镜和连接于微量注射器的33 G针头。
   1. 将眼球轻柔突出，并用镊子固定其位置。
   2. 随后涂抹0.2% w/w卡波姆眼用凝胶或0.3%羟丙甲纤维素眼用凝胶，并在眼球上方放置圆形盖玻片（直径7 mm）。
   3. 将33 G皮下注射针头安装至5 µL Hamilton注射器上，以约45°注射角度，在距角膜缘约2 mm处环形穿刺进入眼内。
   4. 引导针头斜面进入玻璃体腔，停止位置位于晶状体与视盘之间（从术者视角看，针尖位于视盘上方/覆盖视盘区域，距离穿刺点约1.5 mm），缓慢注入2 µL Mtb（PBS中浓度为2.5 µg/µL）。
   5. 短暂保持针头原位（以减少注射液反流），然后将其拔出。
   6. 注射后，松开镊子使眼球复位。此时可在眼表滴加1% w/w氯霉素眼膏，以进一步预防注射后眼内炎。
   7. 注射后处理参照步骤4.3.11-4.3.13，转移至恢复用保温箱中。

5. 采用光学相干断层扫描成像检测和量化葡萄膜炎

1. 动物准备
   1. 按照步骤 4.1.2-4.1.4 所述方法对小鼠进行麻醉
   2. 用 1 滴 2.5% 去氧肾上腺素散瞳。注意避免多余的液体进入鼻腔或口腔。2-3 分钟后，用棉签吸去多余液体。
   3. 在眼睛上滴加 0.3% 羟丙基甲基纤维素或 0.2% w/w 卡波姆凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥。这也有助于预防白内障的形成。
   4. 用一层手术纱布包裹小鼠以维持体温，并将其放置在动物载物台上。用门齿固定装置固定头部。
2. 获取前房和后房的 OCT 图像。
   注意：若需同时获取前房和后房图像，应先获取后房（PC）图像，以避免白内障形成后影响图像质量。频繁使用润滑剂并涂抹 0.3% 羟丙基甲基纤维素或 0.2% w/w 卡波姆眼用凝胶可预防白内障形成。对于长时间成像（>10 分钟），使用加热垫保持小鼠体温也有帮助。
   1. 开启 OCT 成像系统后，安装正确的成像镜头，并根据需要调整参考臂位置。
   2. 打开成像软件，创建唯一的小鼠编号，并按照 OCT 设备制造商的协议开始成像。
   3. 使用 Free Run 模式和快速扫描协议，调整眼睛位置，使视神经位于后房图像的中心，或使角膜顶点位于前房图像的中心。
      注意： 表 1 列出了两种 commercially available 小动物成像系统的成像参数。产品规格请参见材料表。
   4. 进行后房成像时，将 OCT 探头靠近眼球表面。注意避免镜头表面与眼睛接触。
   5. 眼睛正确对位后，停止快速扫描，选择体积扫描协议，并使用 Aim 选项启动扫描。
   6. 对于后段图像，调整位置，使水平 B 扫描对齐图像中的视神经居中，且视网膜与垂直对齐轴对齐。
   7. 对于前段图像，调整位置，使角膜顶点在水平 B 扫描对齐图像和垂直对齐 B 扫描对齐图像中均居中。两个图像中均出现反射伪影表明对位正确。然后将水平图像轻微移动以消除反射伪影。参见 图 2。
   8. 单击 Snapshot 捕获体积扫描图像，然后单击 Save 保存。
   9. 接下来，获取平均中心线扫描图像。打开扫描协议，依次单击 Aim 和 Snapshot。在相同面板上右键单击，然后选择 Average。
   10. 对每只眼睛使用两个镜头重复步骤 5.2.1-5.2.9。
   11. 所有图像采集完成后，将小鼠从载物台上取下，并按照步骤 4.3.11-4.3.13 所列方法在恢复期间提供角膜保护。

6. 通过光学相干断层扫描（OCT）对炎症进行评分

1. 在对治疗条件设盲的评分人员协助下，对 OCT 图像进行评分。
   注意： 对于小鼠模型中的 PMU，建议使用表 2中提供的评分系统。
2. 如果获取了前房（AC）和后房（PC）的图像，则将这两部分的评分合并，以获得每只眼睛的最终评分。
   注意： 前房炎症的消退早于后房炎症。

表1：扫描参数。（A）OCT扫描参数。（B）眼底/视网膜OCT扫描参数

A
小鼠前房	快速扫描	体积扫描	线性扫描
长度 × 宽度	4.0 mm × 4.0 mm	3.6 mm × 3.6 mm	3.6 mm
角度	0	90	90
A扫描/B扫描	800	1000	1000
# B扫描	50	400	1
每B扫描帧数	1	3	20
小鼠后房	快速扫描	体积扫描	线性扫描
长度 × 宽度	1.6 mm × 1.6 mm	1.6 mm × 1.6 mm	1.6 mm
角度	0	0	0
A扫描/B扫描	800	1000	1000
# B扫描	50	200	1
每B扫描帧数	1	3	20
B
小鼠后房	体积扫描	线性扫描
长度 × 宽度	0.9 mm × 0.9 mm	1.8 mm
角度	0	任意（通常为0或90）
A扫描/B扫描	1024	1024
# B扫描	512	1
每B扫描帧数	1	30

表2：PMU OCT评分标准：根据表中列出的标准对OCT图像进行评分。将AC和PC的得分相加，得到该眼的最终得分。对于未能获得清晰眼部图像的情况，图像被赋予NA评分，并从研究中排除。

	OCT 评分说明
评分	前房	后房
NA	无法观察到角膜前部以外的结构	无法观察到眼后段
0	无炎症	无炎症
0.5	房水中可见 1–5 个细胞	少量细胞，占据玻璃体区域不足 10%
	或角膜水肿	无脉络膜下或视网膜内浸润，无视网膜结构破坏
1	房水中可见 6–20 个细胞	弥散性细胞（无致密团块），占据玻璃体区域的 10% 至 50%
	或晶状体前囊上有一层细胞	无脉络膜下或视网膜内浸润，无视网膜结构破坏
2	房水中可见 20–100 个细胞	弥散性细胞（无致密团块），占据> 50% 的玻璃体区域
	或少于 20 个细胞且存在前房积脓	无脉络膜下或视网膜内浸润，无视网膜结构破坏
3	房水中可见 20–100 个细胞	弥散性细胞，程度相当于 2 级和 1 级
	且存在前房积脓或瞳孔膜	且至少存在一个致密的玻璃体混浊，占据玻璃体区域的 10%–20%，或玻璃体细胞程度相当于 2 级，并伴有少量（≤ 2 个）脉络膜下或视网膜内混浊
4	房水中任意数量的细胞	致密的玻璃体混浊，占据> 20% 的玻璃体区域
	且存在大量前房积脓和瞳孔膜，或因严重炎症导致眼前段结构丧失	或弥散性玻璃体细胞，伴有大的脉络膜下或视网膜内混浊

结果

图1：小鼠玻璃体内注射装置示意图。 玻璃体内注射在小鼠眼部进行，使用（A）连接至（B）微型泵的微量注射泵控制器，以及（C）注射用微量注射器。注射器装载后安装于（D）微型泵上。通过（E）耳杆固定小鼠头部，以确保玻璃体内注射过程中位置稳定且操作一致。（F）注射液中的荧光素在成功注射后可在眼内产生绿色反光。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AK-FLUOR	美国伊利诺伊州阿科恩制药公司		5 mL 小瓶装 10% 荧光素钠（100 mg/mL）
AnaSed	美国伊利诺伊州阿科尔恩动物健康公司	NDC 59399-110-20	赛拉嗪 20 mg/mL
5% 碘伏无菌眼科清洗液	美国德克萨斯州阿尔康	8007-1
B-D 精密滑针 -25 G	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	305122
B-D Precision Glide 针头 -30-G	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	305106
Bond MAX，Bond Rx	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		全自动IHC染色系统
氯霉素软膏	英国罗姆福德，马丁代尔制药公司		1% w/w 氯霉素
EG1150H	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		组织包埋
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		OCT 机器
弗氏不完全佐剂	BD Difco，新泽西州，美国	263910
GenTeal 润滑眼膏	美国德克萨斯州阿尔康	---
GenTeal 润滑眼用凝胶	美国德克萨斯州阿尔康	---
H37Ra 冻干分枝杆菌提取物	BD Difco，新泽西州，美国	231141
Hamilton RN 针头 (33/12/2)S	Hamilton，美国内华达州雷诺	7803-05(33/12/2)	33 G
汉密尔顿注射器	Hamilton，美国内华达州里诺市	CAL7633-01	5 µL
胰岛素注射针头	Exel International，美国	26029	1 mL
异氟烷
Ketaset	硕腾，美国	377341	氯胺酮盐酸盐 100 mg/mL
显微注射器泵和Micro4Controller	美国佛罗里达州，世界精密仪器公司	UMP3
Micron IV	Phoenix Research Laboratories，普莱森顿，加利福尼亚州		替代成像/OCT设备
Nanofil 10 µL 注射器	美国佛罗里达州世界精密仪器公司	NANOFIL
Nanofil 眼内注射套件	美国佛罗里达州，世界精密仪器公司	IO-KIT
Olympus SZX10	Olympus		解剖显微镜
PBS	Gibco	14190
盐酸去氧肾上腺素滴眼液 USP 2.5%，无菌，15 mL	美国伊利诺伊州阿科恩制药公司	17478020115
RM2255	Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国		组织切片
结核病注射器	Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国	309602	1 mL
0.5%丁卡因	美国德克萨斯州阿尔康	1041544
Tissue Tek VIP 系列	Sakura Finetek USA, Inc., CA		组织学组织处理
1% 托吡卡胺	英国罗姆福德乔文制药公司		最小量
泰诺	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, 美国	NDC 50580-614-01	对乙酰氨基酚
维适泰	诺华制药，英国坎伯利		0.2% w/w 卡波姆眼用凝胶