利用磷酸流式细胞术评估基质细胞因子诱导的细胞内蛋白磷酸化

摘要

来源：Coats, J. S., 等. 通过细胞因子转导的基质细胞系注射在患者来源的异种移植瘤中表达外源性细胞因子. J. Vis. Exp. (123) (2017)。

本视频展示了白血病细胞中由基质细胞因子诱导的蛋白质细胞内磷酸化的评估方法。这些细胞内磷酸化蛋白通过磷酸化流式细胞术进行定量。

方案

1. 磷酸化流式细胞术检测评估基质细胞产生的细胞因子活性

注意：在首次实验前，应检测经基因改造的基质细胞产生的上清液，以验证该基质所分泌的细胞因子在特定实验中的相关生物活性。一旦确认改造后的基质细胞符合要求，在未引入使用新载体构建的基质细胞的情况下，无需再次进行检测。

1. 购买MUTZ5和/或MHH-CALL4白血病细胞系（TSLP响应性）、重组人细胞因子，以及经批准可用于磷酸化流式细胞术检测的抗体，以检测相应的下游磷酸化靶点。
2. 解冻来自对照组和表达细胞因子的基质细胞的收获上清液。
3. 将白血病细胞系以0.2 × 10⁶ 个细胞/孔的浓度接种于96孔组织培养板中，培养基为R20（见材料表）。每种实验条件设3个复孔，以进行三复孔检测。在37 °C下孵育2小时。此孵育时间可消除细胞在先前培养条件下可能产生的任何磷酸化状态。
   注意：每种细胞系设置12个孔，可为步骤1.4中列出的每种实验条件提供三复孔检测。
4. 培养2小时后，将各孔中的细胞转移至独立的4 mL离心管中，在4 °C下以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。
   1. 将细胞重悬于200 µL体积中，分别用于以下实验条件（每种条件进行三复孔检测）：1）阴性对照—仅培养基；2）阳性对照—含饱和浓度重组细胞因子的培养基（如TSLP为15 ng/mL，etc.）；3）对照基质—来自对照基质细胞的上清液；4）细胞因子基质—来自表达细胞因子的基质细胞的上清液。
5. 根据特定商业磷酸化检测试剂盒推荐的时间进行孵育（例如，MUTZ5或MHH-CALL4细胞在TSLP刺激下检测磷酸化STAT5时，孵育30分钟）。
6. 在4 °C下以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。
7. 按照制造商的方案进行磷酸化流式细胞术染色，并采集流式细胞术数据。
8. 分析流式细胞术数据。
   1. 根据前向散射光（FSC，反映细胞大小）和侧向散射光（SSC，反映细胞颗粒度）对完整细胞进行设门。
   2. 测定各样本中完整细胞的中位荧光强度（MFI）。将基质细胞上清液三复孔检测所得的平均MFI值与阳性对照和阴性对照培养基的MFI值进行比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 血清学移液管	Falcon	357551
15 mL 聚丙烯圆锥形试管	Fisher	05-539-12
50 mL 聚丙烯锥形管	Falcon	352098
1 mL 移液器吸头	Fisher	2707509
200 μL 移液器吸头	德文特科学公司	P3020-CPS
10 μL 吸头	德文特科学	P-1096-CP
“R20”细胞培养基，占总体积的百分比（配制195 mL）			实验方案
RPMI，76.84%（150 mL）	Mediatech	10-040-CV
FBS，20.49%（40 mL）	Mediatech	35-011-CV
2 mM L-谷氨酰胺，1.02%（2 mL）	Mediatech	35-011-CV
1 mM Na-丙酮酸盐，1.02%（2 mL）
青霉素-链霉素，0.51%（1 mL）	Mediatech	30-002-Cl
2-巯基乙醇，0.10%（0.1 M），0.10%（200 µL）	MP	190242
生物制剂
"CALL-4" MHH-CALL-4细胞系，人B细胞前体白血病	DSMZ	ACC 337
MUTZ-5细胞系，人类B细胞前体白血病	DSMZ	ACC 490
重组人TSLP蛋白	R&D 系统	1398-TS-010
流式细胞术抗体（克隆）*
抗小鼠 CD45 FITC（30F11）	Miltenyi Biotec	130-102-778
CD127 PE（MB15-18C9）（别名为 IL-7Rα）	Miltenyi Biotec	130-098-094
CD34 APC（8G12）	BD Biosciences	340667
CD45 PE-Cy7（HI30）	eBioscience	25-0459
"FVD" 可固定活力染料 eFluor 780	eBioscience	65-0865
Ig κ轻链 FITC（G20-193）	BD Pharmingen	555791
Ig λ轻链FITC（JDC-12）	BD Pharmingen	561379
IgD PE（IA6-2）	BioLegend	348203
IgM PE-Cy5（G20-127）	BD 生物科学	551079
pSTAT5 PE，小鼠抗-STAT5（pY694）	BD PhosphoFlow	612567
其他材料 & 设备
FlowJo 流式细胞术分析软件	FlowJo, LLC	版本 10
*所有抗体均为抗人源，除非另有说明。