来源：Neugent, M. L. 等，利用16S rRNA荧光原位杂交法检测膀胱活检组织中的组织驻留细菌 J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了尿路感染患者去石蜡化的膀胱组织中细菌的可视化。荧光标记的探针与细菌16S核糖体RNA杂交，可揭示与组织相关的细菌及其分布情况，从而提供有关样本内细菌密度的空间信息。
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方法文章
通过荧光原位杂交技术在膀胱活检切片中可视化细菌
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 固定和石蜡包埋用组织制备
注意： 活检样本取自接受膀胱镜检查并进行三角区电灼治疗三角区炎以进一步管理复发性尿路感染（rUTI）的知情同意女性。rUTI 定义为 12 个月内发生 3 次尿路感染。活检采集在手术室中进行，患者在签署知情同意书后于麻醉状态下接受操作。所有样本在实验前均进行编码并去标识化处理。
- 使用输尿管钳经柔性膀胱镜从膀胱三角区获取一块冷杯活检组织（约1 mm3），并立即将其放入含有1.5 mL 4% v/v 多聚甲醛（PFA）的无菌2 mL 冻存管中，PFA需用1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配制。
注意： 4% PFA的1× PBS溶液可预先配制，并在-20 °C下保存，直至使用。 - 在室温下固定6小时，或在4 °C下固定16–24小时。
注意： 固定时间应根据组织样本大小计算，避免过度固定。不建议使用戊二醛作为固定剂，因其会引入自发荧光。 - 在无菌操作台或生物安全柜中，用移液器吸除固定液，并替换为1.5 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将样本在4 °C下保存过夜，或立即进行组织处理和石蜡包埋。
- 使用无菌切片机将组织块切成5 μm厚度的切片，并将石蜡包埋的组织切片贴附于带电荷的玻璃载玻片上。每份活检样本至少需要准备两张载玻片，用于16S核糖体RNA（16S rRNA）荧光原位杂交（FISH）实验。
注意： 活检组织应相对于切面呈横截面排列，以确保在所有切片中均可观察到尿路上皮层。还应注意，切片厚度应优化以利于细菌群落的检测；在组织驻留细菌极稀少的感染情况下（例如，<每1,000个哺乳动物细胞中少于1个组织驻留细菌），可能需要更薄的切片或连续多张切片取样。
2. 使用通用 16S rRNA 探针进行荧光原位杂交
注意： 每份活检样本需准备两张载玻片。一张用于通用的16S rRNA探针，另一张用于带有随机序列的对照探针。由于膀胱上皮在多个通道中具有自发荧光，显微镜观察时需通过此方法区分真实信号与背景信号。此外，在封片前使用0.1%苏丹黑B进行封闭处理，可进一步降低组织固有的自发荧光背景。
- 试剂准备与通风橱
- 用70%乙醇清洁一个空的通风橱（或适当适配的生物安全柜）。
- 配制杂交缓冲液，包含0.9 M氯化钠（NaCl）、20 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，pH 7.2）、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），溶于10 mL无菌滤过水中。
注意： 无菌过滤水可通过将高压灭菌的蒸馏水经0.22 μm滤膜过滤制备。杂交缓冲液可在室温下保存，但SDS可能从溶液中析出。若SDS析出，使用前将溶液置于50 °C水浴中温育。 - 在清洗并经高压灭菌的瓶中，用无菌过滤水分别配制至少100 mL的95%和90%乙醇。
- 将荧光标记的冻干探针溶解于用滤膜除菌的无核酸酶水中配制的10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TE缓冲液）中，终浓度为100 μM。用TE缓冲液进一步稀释至1 μM，用于本实验方案。将100 μM的浓缩储备液和1 μM的工作储备液探针置于-20 °C避光保存。
注意： 切勿将荧光标记的探针溶解于水中。必须使用缓冲液以防止将荧光团与核苷酸探针连接的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯键发生水解。 - 用70%乙醇（EtOH）清洗五个柯普林瓶，晾干后分别标记为：二甲苯I、二甲苯II、95% EtOH、90% EtOH、重蒸水（ddH₂O）2O），并用100 mL相应的溶液填充。这有助于避免后续步骤中的混淆。
- 组织脱蜡与复水
- 在通风橱内，将每份活检样本的两张载玻片放入垂直的载玻片架中。
- 将一个垂直放置的载玻片架放入二甲苯I科卜林瓶（内含100 mL二甲苯）中，处理10分钟。
- 将载玻片架从二甲苯 I 中取出，用纸巾轻拭底部以去除多余的二甲苯，然后放入二甲苯 II 柯铂瓶中处理 10 分钟。
注意： 切勿在未经认证的通风橱外操作二甲苯。 - 在分别标记的 Coplin 染色缸中，使用梯度乙醇溶液（95% 和 90%）依次对脱蜡组织切片进行水化，每步各 10 分钟。
注意： 在此阶段，将杂交缓冲液在水浴中加热至 50–56 °C。 - 从90%乙醇洗涤液中取出载玻片架，用纸巾轻拭底部以去除多余乙醇，然后放入ddH₂O中2一个 Coplin 染色缸中含有 100 mL 过滤除菌的 ddH₂O2O 型 10 分钟。
- 等待 ddH₂O 的过程中2将探针用杂交缓冲液稀释至10 nM，配制染色液。每张载玻片准备150 μL染色液。
注意： 用铝箔包裹试管并将其存放在抽屉中，以避免染色溶液暴露于光线下。在实验台操作荧光标记探针时，应尽量关闭顶灯。用杂交缓冲液稀释后的探针不得重复使用。
- 杂交与复染
- 为每种探针准备一个加湿孵育盒：将浸湿后揉皱的Kimwipe纸和无菌水放入P1000吸头盒的储水槽中，然后将吸头架卡盒放在上方——载玻片将置于其上。
注意： 使用加湿孵育盒对于防止活检切片在杂交过程中干燥至关重要。需要注意的是，市面上可购得的商用加湿盒虽专为维持稳定且湿润的环境而设计，但本文所述方法能够在显著降低成本的同时有效控制湿度。 - 从载玻片架上取出载玻片，放置于一张干净的纸巾上（组织面向上）。使用擦镜纸轻轻吸干载玻片表面水分，注意仅需在活检组织区域附近（而非直接接触组织）轻拍，以吸除多余水分。使用疏水笔在活检组织周围画出边界，然后将载玻片（组织面向上）放入湿化盒中。
注意： 操作需迅速，以免组织在杂交前干燥。 - 将加湿盒放入设定为 50 °C 的培养箱中。用移液器吸取 50–150 μL 染色液，直接滴加在组织上方，使组织周围疏水边界所形成的矩形区域完全被液体覆盖。注意避免加入过多溶液导致溢出疏水边界。轻轻盖上盒盖。
- 在黑暗条件下于50 °C孵育过夜（约16 h）。如果培养箱带有窗口，需用铝箔覆盖以创造黑暗环境。
注意： 荧光原位杂交探针的杂交温度需低于其熔解温度，以确保信号可靠。对于通用16S rRNA探针，50 °C为最佳杂交温度，但该温度可能不适用于其他探针。 - 次日早晨，准备至少 500 mL 洗涤缓冲液，其中包含 0.9 M 氯化钠（NaCl）和 20 mM Tris-HCl（pH 7.2），用 ddH₂O 配制。2O，并使用真空瓶顶滤器过滤除菌至无菌瓶中。在水浴中加热至50–56 °C。
- 从湿盒中取出载玻片，用无尘纸小心吸去残留的杂交液。将载玻片放入垂直染色架中。
- 将染色架放入含有100 mL预热洗涤缓冲液的不透明考普林瓶中，孵育10分钟。若考普林瓶不为不透明材质（如玻璃），则在孵育步骤期间应将其置于暗处——例如放入盒内或抽屉中。
- 用新的Coplin罐中的新鲜洗涤缓冲液重复洗涤步骤两次。
- 在洗涤步骤期间，用洗涤缓冲液将100 μg/mL的Hoechst 33342储存液按1:1,000稀释，配制复染液。向同一管中加入Alexa-555标记的小麦胚芽凝集素（WGA），使其终浓度为5 μg/mL，再加入Alexa-555标记的鬼笔环肽（Phalloidin），使其终浓度为33 nM。避光保存，待用时取出。
注意： Hoechst、Alexa-555 WGA 和 Alexa-555 Phalloidin 分别标记脱氧核糖核酸（DNA）、黏液素/尿斑蛋白和肌动蛋白，根据制造商说明可在避光条件下长期保存。探针和复染所用的荧光标记可根据拟使用显微镜的滤光片组进行定制。 - 从最后一次洗涤中取出载玻片，用无尘纸轻轻吸去多余的洗涤缓冲液。将载玻片组织面向上放置在纸巾上，直接在组织上滴加50–150 μL复染液，使疏水边界区域被完全覆盖但不溢出。用冷冻盒盖覆盖最多四张载玻片，室温孵育10分钟。
- 将玻片放回染色架中，再用新鲜的洗涤缓冲液在考普林瓶中洗涤两次，每次10分钟。
- 彻底干燥最后一次洗涤后的载玻片，将组织面向上放置在纸巾上，并置于冷冻盒盖下方。将一滴封片剂直接滴加在组织上，轻轻盖上合适大小的盖玻片（根据活检样本大小选择）。轻压排除任何气泡，以免影响成像效果，并将加盖盖玻片的载玻片置于避光环境中过夜固化。
- 第二天，用一层薄薄的透明指甲油将盖玻片边缘密封固定在载玻片上。在避光条件下干燥10分钟，随后于4 °C避光保存，用于共聚焦显微镜观察。
- 为每种探针准备一个加湿孵育盒：将浸湿后揉皱的Kimwipe纸和无菌水放入P1000吸头盒的储水槽中，然后将吸头架卡盒放在上方——载玻片将置于其上。
3. 共聚焦显微镜观察16S rRNA FISH
注意： 本实验方案建议使用配备63倍和100倍物镜的激光扫描共聚焦显微镜，以获得最佳结果。需要配备用于观察Hoechst、Alexa-488和Alexa-555荧光的合适滤光片组。然而，若无共聚焦显微镜，也可使用常规荧光显微镜。本方案适用于激光扫描共聚焦显微镜。
- 根据制造商的说明，打开共聚焦显微镜及其配套的计算机软件。
- 加载玻片，并使用10倍物镜在蓝色（Hoechst）通道中观察。仔细调焦，直至细胞核清晰可见。
- 调焦完成后，更换至高倍物镜（63x 或 100x）。在盖玻片上滴加镜油，使用新物镜重新调焦，确保调焦过程中物镜镜头与镜油接触。
注意： 在高倍放大（63x 或 100x）下仅使用细调焦。镜油仅可用于油浸物镜。 - 通过目镜在绿色（增强型绿色荧光蛋白，eGFP/Alexa-488）通道中快速评估每张玻片，以确定哪些为FISH阳性，哪些为FISH阴性。
注意： 为减少实验偏差，最好由另一名独立操作人员以盲法进行初步评估/判读。 - 为成像染色的活检样本，首先选择一张FISH阳性的玻片并切换至计算机成像模式。选择405（Hoechst）、488（Alexa-488）和555（Alexa-555）通道。使用最长波长的通道（此处为555）设置针孔。在488通道中找到标记细菌的正确焦平面。保持焦平面不变，调节各通道的增益、激光功率和偏移量，使信号不饱和且背景不过度校正。在所有三个通道中采集图像。
注意： 实验中每张玻片的488通道应使用相同设置。若不同视野中细菌成像的最佳焦平面发生变化，可能需要调整405和555通道的激光功率。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | 标记肌动蛋白 |
| Alexa-555 小麦胚芽凝集素 (WGA) | Invitrogen | W32464 | 标记黏蛋白 |
| 瓶顶滤器 | Fisher Scientific | 09-741-07 | 灭菌 |
| Coplin 染色缸 | Simport | M900-12W | 脱蜡/洗涤 |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5M | 显微镜观察 |
| 乙醇 | Fisher Scientific | 04-355-224 | 再水化 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| 磨砂载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 | Invitrogen | H21492 | 细胞核染色 |
| 疏水性标记笔 | Vector Laboratories | H-4000 | 建立疏水屏障 |
| Kimwipes 擦镜纸 | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| 浸油 Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | 显微镜观察 |
| 多聚甲醛 (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | 固定 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | 封片介质 |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-10 | 杂交缓冲液/PBS |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher Scientific | BP166-500 | 杂交缓冲液 |
| 磷酸氢二钠七水合物 | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| 磷酸二氢钠一水合物 | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| 注射器 | VWR | 75486-756 | 灭菌 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/杂交缓冲液 |
| 二甲苯 | Fisher Chemical | X3P-1GAL | 脱蜡 |
| 0.22 微米注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-754-29 | 灭菌 |
