通过荧光原位杂交观察膀胱活检切片中的细菌

摘要

来源:Neugent， M. L. et al.， 通过 16S rRNA 荧光原位杂交检测膀胱活检中的组织驻留细菌。J. Vis. Exp. （2019 年）

该视频演示了尿路感染患者脱蜡膀胱组织中细菌的可视化。荧光标记探针与细菌 16s 核糖体 RNA 杂交揭示了组织相关细菌及其分布，为它们在样品中的密度提供了有价值的空间见解。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 固定和石蜡包埋的组织制备

注:活检取自同意接受膀胱镜检查联合三角炎电电灼术的妇女，用于复发性尿路感染 （rUTI） 的高级管理。rUTI 定义为 12 个月内 3 次 UTI。在获得患者知情同意后，在患者麻醉期间在手术室进行活检采集。所有样本在实验前都经过编码和去标识化处理。

1. 通过可弯曲膀胱镜用泌尿钳从膀胱三角区获得冷杯 （~1 mm³） 活检，并立即放入含有 1.5 mL 4% v/v 多聚甲醛 （PFA） 的无菌 2 mL 冷冻管中，在 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备。
   注意:可以提前制备 1x PBS 中的 4% PFA 并储存在 -20 °C 以备需要。
2. 在室温下固定活检 6 小时或在 4 °C 下固定活检 16-24 小时><。 注意:固定时间应根据组织样本的大小计算，应避免过度固定。不建议使用戊二醛作为固定剂，因为它会引入自发荧光。
3. 在无菌罩或生物安全柜中，通过移液去除固定剂，并用 1.5 mL 无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 替换。将样品在 4 °C 下放置过夜或立即进行组织处理和石蜡包埋。
4. 使用灭菌的切片机以 5 μm 的厚度切片组织块，并将石蜡组织切片粘附在带电玻璃显微镜载玻片上。16S 核糖体 RNA （16S rRNA） 荧光原位杂交 （FISH） 方案每次活检至少需要两张载玻片><。 注意:活检组织应相对于切割平面进行横截面布置，以确保所有切片中尿路上皮层的可视化。还应该注意的是，应优化切片厚度以进行细菌群落检测。在组织驻留细菌极度稀少的感染情况下（例如，每 1,000 个哺乳动物细胞中 <1 个组织驻留细菌），可能需要更薄的切片或多个连续切片的采样。

2. 使用通用 16S rRNA 探针进行荧光原位杂交

注意:每次活检需要两张载玻片。通用 16S rRNA 探针需要一张载玻片，具有加扰序列的对照探针需要一张载玻片。这对于在显微镜检查过程中区分真实信号和背景信号很重要，因为膀胱上皮在多个通道中会发出自发荧光。除了加扰探针外，在安装前用 0.1% 苏丹黑 B 封闭可能会减少组织中固有的背景自发荧光。

1. 试剂和通风橱的制备
   1. 用 70% 乙醇清洁空通风橱（或适当安装的生物安全柜）。
   2. 在 10 mL 无菌过滤水中制备由 0.9 M 氯化钠 （NaCl）、20 mM Tris（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，pH 7.2）、0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 组成的杂交缓冲液。
      注:无菌过滤水可以通过将高压灭菌的蒸馏水通过 0.22 μM 过滤器来制备。杂交缓冲液可以在室温下储存，但 SDS 可能会从溶液中沉淀。如果 SDS 沉淀，请在使用前在 50 °C 水浴中加热溶液。
   在
   3. 无菌过滤水中制备至少 100 mL 的 95% 和 90% 乙醇，装在清洗过的高压灭菌瓶中。
   将
   4. 荧光标记的冻干探针溶解在 10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 和 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 缓冲液 （TE） 中，在过滤灭菌的无核酸酶水中制备至终浓度为 100 μM。在 TE 缓冲液中制备 1 μM 的稀释液以用于本方案。将 100 μM 浓缩原液和 1 μM 原液重组探针储存在 -20 °C 下，避光保存。
      注:请勿将荧光标记的探针溶于水中。需要缓冲以防止将荧光基团偶联到核苷酸探针上的 N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 酯键水解。
   5. 用 70% 乙醇 （EtOH） 清洁五个 Coplin 染色缸，晾干，按如下方式标记:二甲苯 I、二甲苯 II、95% 乙醇、90% 乙醇、双蒸水 （ddH₂O），并填充 100 mL 适当的溶液。这将有助于避免在后续步骤中产生混淆。
2. 组织脱蜡和再水化
   1. 在通风橱中，将每次活检的两张载玻片放入垂直载玻片架中。
   2. 将垂直载玻片架放入二甲苯 I Coplin 染色缸（含有 100 mL 二甲苯）中 10 分钟。
   3. 从二甲苯 I 上取下载玻片架，用纸巾吸干底部以去除多余的二甲苯。放入二甲苯 II Coplin 罐中 10 分钟
      注意:切勿在经过认证的通风橱之外使用二甲苯。
   在
   4. 分别标记的 Coplin 染色缸中，连续乙醇洗涤（95% 和 90%）再水化脱蜡组织切片，每次 10 分钟><。 注:在此阶段，在水浴中将杂交缓冲液加热至 50-56 °C。
   5. 从 90% 乙醇洗涤液中取出载玻片架，用纸巾吸干底部以去除多余的乙醇，然后放入含有 100 mL 过滤灭菌 ddH₂O 的 ddH₂O Coplin 罐中 10 分钟。
   6. 在等待 ddH₂O 洗涤时，在杂交缓冲液中将探针稀释至 10 nM 以制备染色溶液。每张载玻片准备 150 μL 染色溶液。
      注:将试管包裹在铝箔中并存放在抽屉中，以保护染色溶液避光。在工作台上使用荧光标记的探针时，请考虑尽可能关闭头顶灯。在杂交缓冲液中稀释的探针不应重复使用。
3. 杂交和复染
   1. 通过将浸泡过、皱巴巴的 Kimwipe 和无菌水放入 P1000 吸头盒的水箱中，为每个探针准备一个加湿室。将吸头支架放在顶部 - 这是载玻片的位置。
      注意:使用加湿室以防止活检切片在杂交过程中变干非常重要。应该注意的是，市售的加湿器室旨在保持稳定、潮湿的气氛。但是，此处详述的技术可以以大大降低的成本充分控制湿度。
   2. 从载玻片架上取下载玻片，将它们放在干净的纸巾上（纸巾面朝上）。使用 Kimwipe 擦干载玻片。小心只在活检切片附近（而不是在活检切片上）轻轻轻拍以吸走水分。使用疏水笔，在活检切片周围画一个边界，并将载玻片组织面朝上放入加湿室中。
      注意:快速工作，使组织在杂交前不会变干。
   3. 将加湿室放入设置为 50 °C 的培养箱中。将 50-150 μL 染色溶液直接移液到组织顶部，以填充组织周围疏水边界形成的矩形。小心不要添加过多的溶液以溢出疏水边界。轻轻合上包装盒。
   4. 在 50 °C 下在黑暗中孵育过夜（~16 小时）。如果培养箱有窗户，请用铝箔覆盖它以创造一个黑暗的环境。
      注:为了获得可靠的信号，需要低于 FISH 探针熔解温度的杂交温度。50 °C 是通用 16S rRNA 探针的最佳温度，但对于其他探针可能不是最佳温度。
   5. 第二天早上，准备至少 500 mL 洗涤缓冲液，由 0.9 M 氯化钠 （NaCl） 和 20 mM Tris-HCl （pH 7.2） 的 ddH₂O 溶液组成，并过滤灭菌到带有真空瓶顶过滤器的无菌瓶中。在水浴中加热至 50-56 °C。
   6. 从加湿室中取出载玻片，然后用 Kimwipe 小心地吸走任何残留的杂交溶液。将玻片放在垂直染色架中。
   7. 将染色架放入含有 100 mL 预热洗涤缓冲液的不透明 Coplin 染色缸中 10 分钟。如果 Coplin 罐子不是不透明的（例如玻璃），请在孵育步骤中将它们放在黑暗中——可能在盒子下或抽屉里。
   8. 在新的 Coplin 染色缸中用新鲜的洗涤缓冲液重复洗涤步骤两次。
   9. 在洗涤步骤中，通过在洗涤缓冲液中稀释 100 μg/mL Hoechst 33342 1:1,000 储备液来制备复染剂。在同一管中，添加 Alexa-555 小麦胚芽凝集素 （WGA） 至终浓度为 5μg/mL，加入 Alexa-555 鬼笔环肽至终浓度为 33 nM。避光存放，直到准备好使用。
      注意:Hoechst、Alexa-555 WGA 和 Alexa-555 鬼笔环肽分别标记脱氧核糖核酸 （DNA）、粘蛋白/尿环蛋白和肌动蛋白，并且可以按照制造商的说明在黑暗中长期储存。用于探针和复染剂的荧光标记可以针对显微镜要使用的滤光片组进行定制。
   10. 从上次洗涤中取出载玻片，然后用 Kimwipe 轻轻吸走多余的洗涤缓冲液。将载玻片组织面朝上放在纸巾上，直接在组织顶部添加 50-150 μL 复染剂，以填充疏水边界，但不会溢出。用冷冻盒顶部盖住最多四张玻片，并在室温下孵育 10 分钟。
   11. 将侧面放回染色架中，在带有新鲜洗涤缓冲液的 Coplin 罐中再洗涤两次，每次 10 分钟。
   12. 最后一次洗涤后彻底擦干载玻片，并将组织面朝上放在冷冻盒顶部下的纸巾上。将一滴封固剂直接挤在纸巾上。轻轻地将适当大小的盖玻片（取决于活检大小）放在顶部。轻轻压出任何气泡，因为它们会干扰成像，并让盖玻片在黑暗中固化一夜。
   13. 第二天，用一层薄薄的透明指甲油将盖玻片的边缘密封到载玻片上。在黑暗中干燥 10 分钟，然后在 4 °C 的黑暗中储存以进行共聚焦显微镜检查。

3. 用共聚焦显微镜观察 16S rRNA FISH

注意:对于此协议，使用具有 63 倍和 100 倍物镜的激光扫描共聚焦显微镜可获得最佳结果。需要适当的滤光片组来可视化 Hoechst、Alexa-488 和 Alexa-555 荧光。但是，如果共聚焦显微镜不可用，则可以使用标准荧光显微镜。该协议适用于激光扫描共聚焦显微镜。

1. 按照制造商的说明打开共聚焦显微镜和与显微镜相关的计算机软件。
2. 加载载玻片并使用蓝色 （Hoechst） 通道中的 10 倍物镜进行可视化。仔细聚焦，直到可以看到细胞核。
3. 聚焦后，将物镜更改为高放大倍率（63 倍或 100 倍）。在盖玻片上加油。使用新物镜重新对焦，确保物镜在对焦时与油接触。
   注意:仅在高放大倍率（63 倍或 100 倍）下使用精细对焦。油只能用于油物镜。
4. 通过绿色（增强型绿色荧光蛋白，eGFP/Alexa-488）通道中的目镜快速评估每张玻片，以确定哪些玻片是 FISH 阳性，哪些是 FISH 阴性><。 注意:最好由单独的个体进行初步评估/评分，以减少实验偏差。
5. 要对染色的活检进行成像，请从 FISH 阳性玻片开始，然后切换到计算机可视化模式。选择 405 （Hoechst）、488 （Alexa-488） 和 555 （Alexa-555） 通道。使用最长的波长通道设置针孔，在本例中为 555。找到正确的焦平面，以便在 488 通道中可视化标记的细菌。在不更改焦平面的情况下，设置每个通道的增益、激光功率和偏移，以便信号不会饱和，并且不会过度校正背景。在所有三个通道中采集图像。
   注意:对 488 通道使用相同的设置对实验中的每张玻片进行成像。如果场之间细菌可视化的最佳焦平面发生变化，则可能需要在 405 和 555 通道中调整激光功率。

材料