一种用于紫外线照射介导生成凋亡性T细胞的体外技术

摘要

来源：Hodge, M. X.，等。臭氧暴露后肺泡巨噬细胞胞葬作用的体内评估。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种在Jurkat细胞中诱导凋亡的方法——Jurkat细胞是一种人类T淋巴细胞白血病细胞系。通过将细胞暴露于紫外C（UVC）辐射下，可造成严重的DNA损伤，进而导致细胞发生凋亡性死亡。

方案

1. Jurkat T 细胞系的制备（第2天）

注意：所有操作均应在 II 级生物安全柜中进行。

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，将Jurkat T细胞培养于24 mL基础细胞培养基 + 10% FBS + 5%青霉素/链霉素中（材料表）。Jurkat T细胞为悬浮细胞系，可通过每3天以1:6至1:8比例传代至预热的培养基中进行维持培养。切勿振荡。
2. 为制备凋亡细胞，将细胞在每个培养瓶中培养至90%融合度（传代后约需3-4天达到）。本研究中，使用五个T75培养瓶的细胞，以获得本方案所需的足够细胞数量。
   注意： 一个融合的培养瓶约含有2000万至2400万个细胞。
3. 用移液管将每个培养瓶中的全部细胞（约24 mL）吸出，并使用血清移液管转移至无菌50 mL锥形管中。多个培养瓶需使用多个锥形管。
4. 从50 mL锥形管中取出11 µL细胞样品，与11 µL台盼蓝染液混合，再用移液管取11 µL混合液加入血细胞计数板载片中，进行细胞计数。
5. 将载片插入自动细胞计数仪，记录活细胞数量，并通过将活细胞数乘以24来计算每个培养瓶中的总细胞数（因每个培养瓶含24 mL培养基）。
6. 将细胞悬液在室温（RT）下以271 x g离心5分钟，使细胞沉淀。
7. 通过抽吸弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于培养基中，调整至每毫升含3.0 × 10⁶个细胞。
8. 将5 mL细胞悬液分装至100 mm × 20 mm组织培养皿中（约需九个培养皿；每个培养皿中细胞总数应约为15 × 10⁶）。
9. 保留一个培养皿作为未处理对照组，其余培养皿用于紫外线（UV）照射。
10. 设置紫外交联仪至正确能量水平，按下能量按钮，使用数字键盘输入“600”，仪器将读取为600 µJ/cm² × 100。
    注意： 紫外交联仪的能量单位为µJ/cm² × 100；因此，若需达到60 mJ/cm²，需进行单位换算以匹配仪器设置。
11. 使用紫外交联仪对所有含细胞的培养皿（不包括对照组）进行60 mJ/cm²的照射。照射期间需移除组织培养皿的顶部盖子，因为紫外光无法穿透塑料盖。
12. 将所有培养皿（包括未照射的对照组）置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时。
13. 孵育4小时后，按照制造商说明书，使用含annexin V和碘化丙啶（PI）的凋亡检测试剂盒（分别为凋亡和坏死的标志物），通过流式细胞术确认细胞凋亡。
    注意： 将Jurkat T细胞在紫外交联仪中以600 µJ/cm²能量照射，并在照射后孵育4小时，可使≥75%的细胞进入凋亡状态（包括早期和晚期凋亡），其中早期凋亡细胞比例高于晚期凋亡细胞。由于早期凋亡细胞的膜结构完整，更易被肺泡巨噬细胞识别并吞噬，而晚期凋亡细胞膜完整性受损，因此本研究中可获得更高的胞葬指数，并更准确地成像肺泡巨噬细胞的胞葬过程。
    1. 从多个培养皿（包括“无UV”和“UV照射”组）中合并333 µL（1 × 10⁶个细胞）Jurkat T细胞，用于补偿分析管。
    2. 将333 µL Jurkat T细胞分装至未染色管、annexin V单染管、PI单染管、无UV对照管及600 µJ/cm² UV照射标记的流式管中。
    3. 在室温下以188 x g离心5分钟，倾去上清液。
    4. 用500 µL冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，进行洗涤。
    5. 在室温下以188 x g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后弃去上清液。
    6. 在细胞离心期间，用去离子水稀释10×结合缓冲液，为每根流式管配制400 µL 1×结合缓冲液。
    7. 根据制造商说明书，配制annexin V和PI孵育试剂（每样品/管100 µL）。
    8. 离心后倾去上清液，轻柔地将所有管中的细胞重悬于400 µL 1×结合缓冲液中，然后向每根样品管中加入100 µL annexin V孵育试剂。最后，向相应的单染管中分别加入100 µL annexin V单染液和PI单染液，但未染色管中仅保留1×结合缓冲液，不添加任何染料。
    9. 将各管在避光条件下室温孵育15分钟。
    10. 在室温下以188 x g离心5分钟，倾去上清液。
    11. 将细胞重悬于400 µL 1×结合缓冲液中，然后通过流式细胞术分析凋亡情况。每管至少采集10,000个事件，以确保染色结果的准确代表性。
14. 将所有经照射的细胞从培养皿中合并至一个50 mL锥形管中，在室温下以271 x g离心5分钟，使细胞沉淀。
15. 通过抽吸弃去管中上清液，将细胞重悬于24 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在室温下以271 x g离心5分钟，再次沉淀细胞。
16. 通过抽吸弃去管中上清液，将细胞重悬于经IACUC批准用于小鼠给药的PBS体积中。每只小鼠的给药剂量为5-10 × 10⁶个细胞/50 µL；因此，对于10只小鼠，应将细胞重悬于500 µL PBS中（每剂细胞数量取决于用于照射培养的细胞总数）。
    注意： 应额外制备至少两个剂量，以补偿可能粘附在移液器吸头壁上的液体导致的细胞损失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Annexin V-FITC 试剂盒	Trevigen	4830-250-K	使用流式细胞术时，TACS Annexin V-FITC 试剂盒可对单个细胞的凋亡进行快速、特异且定量的鉴定。
BCL2 Jurkat T 细胞	ATCC	ATCC CRL-2899	BCL2 Jurkat 细胞系是通过将含有人 BCL-2 开放阅读框插入片段和新霉素抗性基因的 pSFFV-neo 哺乳动物表达载体转染入人 Jurkat T 细胞而获得。该细胞系已用于吞噬凋亡细胞（efferocytosis）模型的研究。
Countess II 自动细胞计数仪	Thermofisher	AMQAX1000	该仪器为台式检测平台，配备先进的光学系统、全自动对焦功能及图像分析软件，可快速评估悬浮细胞，操作极为简便。
Cytospin 4 细胞离心涂片机	Thermofisher	A78300003	可从任何液体基质中制备经济高效的薄层样本，尤其适用于细胞含量较低的液体，如支气管肺泡灌洗液。
胎牛血清，经鉴定，热灭活	Thermofisher	16140071	为培养细胞提供生长所需的营养物质，是细胞培养中的标准添加物。
青霉素-链霉素	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	青霉素-链霉素是哺乳动物细胞培养中最常用的抗生素溶液，也可用于维持细胞培养过程中的无菌环境。
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物	Thermofisher	61870036	RPMI 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基）最初用于悬浮培养和单层培养人白血病细胞。此后发现该培养基适用于多种哺乳动物细胞，包括 HeLa、Jurkat、MCF-7、PC12、PBMC、星形胶质细胞及癌细胞。有助于 Jurkat T 细胞快速高效地生长。
Stratagene UV Stratalinker 1800 紫外交联仪	Cambridge Scientific	16659	Stratalinker 紫外交联仪设计用于诱导细胞凋亡，或将 DNA 或 RNA 交联至尼龙膜、硝酸纤维素膜或增强型尼龙-硝酸纤维素复合膜上。