使用流式细胞术在存在测试过敏原的情况下分析嗜碱性粒细胞活化

摘要

来源:Doña， I. et al.， 用于过敏诊断的嗜碱性粒细胞活化试验。 （2021 年）

在本视频中，我们演示了使用流式细胞术在存在测试过敏原的情况下评估嗜碱性粒细胞活化的测试。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 样品制备

1. 在 9 mL 肝素化管中收集外周血，并将样品保持在转子中的室温 （RT） 下，直到实验方案需要为止。
2. 标记 5 mL 细胞计数器管，用于阴性对照（2 管）、阳性对照（2 管）和不同浓度的过敏原/药物（每个测试的过敏原/药物浓度 1 管）。将试管放在试管完美贴合且不会滑落的架子上。
3. 在含有 2% （v/v） HEPES、78 mg/L NaCl、3.7 mg/L KCl、7.8 mg/L CaCl₂、3.3 mg/L MgCl₂、1 g/L HSA 的双蒸水中制备刺激缓冲液。将 pH 值调节至 7.4 并添加 2 ng/mL 的 IL-3。通常，制备 100 mL 并分成 2.5 mL 等分试样，在 -20 °C 下冷冻。
4. 在 PBS-Tween-20 0.05% （v/v） （PBS-T） 中制备阳性对照:阳性对照 1，N-甲酰甲硫氨酰 - 亮氨酰 - 苯丙氨酸 （fMLP） （4 μM），以确认嗜碱性粒细胞的质量;阳性对照 2，抗 IgE （0.05 mg/mL） 作为 IgE 介导的阳性对照。
5. 在 PBS-T 中制备所需终浓度 2 倍的过敏原/药物。
   注意:要使用的最佳过敏原/药物浓度必须事先通过使用广泛的浓度、剂量反应曲线以及遵循相同方案步骤的细胞毒性研究来确定。

2. 染色混合物的制备

1. 按照制造商推荐的抗体浓度或先前的抗体滴定，将荧光染料标记的单克隆抗体添加到刺激缓冲液中。在该方案中，我们添加 1 μL 每种抗体（CCR3-APC 和 CD203c-PE 用于嗜碱性粒细胞鉴定;CD63-FITC 用于嗜碱性粒细胞活化）每 20 μL 刺激缓冲液。
   注意:保护染色混合物制备物免受光线照射。
2. 向每个试管中加入 23 μL 染色混合物。

3. 血液刺激

1. 向试管 1 和 2（阴性对照）中加入 100 μL PBS-T，向试管 3 中加入 100 μL fMLP，向试管 4 中加入 100 μL 抗 IgE，向以下试管中加入 100 μL 不同浓度的过敏原/药物。在 37 °C 的恒温浴中孵育 10 分钟，并进行中等搅拌以预热试剂。
2. 向每管中轻轻添加 100 μL 血液以避免溶血。轻轻涡旋试管，并在 37 °C 下在中等搅拌的恒温浴中孵育 25 分钟。
3. 停止脱颗粒，将试管保持在 4 °C 至少 5 分钟。
   注意:如果需要，该方案可以在 4 °C 下暂停 30-45 分钟。

4. 红细胞裂解

1. 向每个试管中加入 2 mL 1x 裂解缓冲液以裂解红细胞。涡旋每个试管并在 RT.
   下孵育 5 分钟 注意:在此步骤中，由于缓冲液中含有固定剂（甲醛），细胞被固定。
2. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。倒出上清液，将架子倒入水槽中。细胞保留在试管底部。
3. 向每个试管中加入 3 mL PBS-T 以洗涤细胞。涡旋每根试管。
4. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。倒出上清液，将架子倒入水槽><中。 注意:将样品保持在 4 °C，避光，直到流式细胞仪采集。

5. 流式细胞术采集

1. 通过流式细胞仪（例如，BD FACSCalibur 流式细胞仪）采集样品。将流式细胞仪连接到计算机软件，然后等待细胞仪准备就绪。加载模板和仪器设置（表 1）。
2. 开始样品采集。
3. 使用以下细胞计数器策略选择活化的嗜碱性粒细胞。
   1. 从侧向散射 （SSC） - 前向散射 （FSC） 图对淋巴细胞进行门控。
   将
   2. 淋巴细胞群中的嗜碱性粒细胞设门为 CCR3 ⁺ CD203c ⁺ 细胞。每管至少获得 500 个嗜碱性粒细胞。
   3. 显示 CCR3 - CD63 图，以使用 CD63 作为激活标志物分析激活。使用阴性对照管将 CD63 阴性阈值设置为约 2.5%。
   4. 获取所有样本。

表 1:流式细胞仪要求

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 光源（激光器） 488 nm Coherent SapphireTM 风冷氩离子激光器;20 mW;633 nm JDS UniphaseTM 氦氖风冷激光器;17 mW 光兴奋波长 蓝色激光:488 nm;红色激光:633 nm 激发波长处的光源功率 蓝色激光:20 mW;红光激光器:17 mW 滤光片 SSC:488/10;FITC: 530/30， PE:585/42， APC: 660/20 光学探测器 FSC、SSC、FL1-H FITC、FL2-H PE、FL4-H APC 光学探测器 风冷式氩离子激光器 光路 BD 八边形（488 nm 激光线）;BD Trigons （633 nm 激光线）

材料