使用流式细胞术分析测试变应原存在下的嗜碱性粒细胞活化

摘要

来源：Doña, I. 等，用于过敏诊断的嗜碱性粒细胞活化试验。视觉化实验杂志（2021）

在本视频中，我们演示了使用流式细胞术检测在试验性变应原存在下嗜碱性粒细胞活化的方法。

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 样品制备

在9 mL肝素抗凝管中采集外周血，并将样本置于室温（RT）下旋转器中保存，直至实验方案需要时使用。
标记5 mL流式管用于阴性对照（2管）、阳性对照（2管）以及不同浓度的过敏原/药物（每种过敏原/药物浓度各1管）。将流式管放置在管架中，确保管子稳固不滑动。
在双蒸水中配制刺激缓冲液，其中包含2%（v/v）HEPES、78 mg/L NaCl、3.7 mg/L KCl、7.8 mg/L CaCl₂、3.3 mg/L MgCl₂、1 g/L HSA。调节pH至7.4，并加入IL-3至终浓度2 ng/mL。通常配制100 mL，分装为每份2.5 mL，于-20 °C冷冻保存。
在含0.05%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）中配制阳性对照：阳性对照1为N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）（4 µM），用于确认嗜碱性粒细胞的质量；阳性对照2为抗IgE抗体（0.05 mg/mL），作为IgE介导的阳性对照。
在PBS-T中配制过敏原/药物，浓度为所需终浓度的2倍。
注意：应通过广泛浓度梯度、剂量-反应曲线以及按照相同实验步骤进行的细胞毒性研究，预先确定所用过敏原/药物的最佳浓度。

2. 染色液配制

根据制造商推荐的抗体浓度或先前的抗体滴定结果，将荧光染料标记的单克隆抗体加入刺激缓冲液中。在本方案中，每20 µL刺激缓冲液中加入1 µL每种抗体（CCR3-APC和CD203c-PE用于嗜碱性粒细胞鉴定；CD63-FITC用于嗜碱性粒细胞活化）。
注意： 染色混合物的制备过程需避光。
向每根试管中加入23 µL染色混合液。

3. 血液刺激

向1号和2号试管中各加入100 µL PBS-T（阴性对照），向3号试管中加入100 µL fMLP，向4号试管中加入100 µL 抗IgE，向后续试管中加入不同浓度的过敏原/药物溶液，每管100 µL。在37 °C恒温水浴中以中等振荡孵育10分钟，使试剂预热。
轻柔地向每支试管中加入100 µL血液，避免溶血。轻轻涡旋混匀各试管，并在37 °C恒温水浴中以中等振荡孵育25分钟。
通过将试管置于4 °C环境中至少5分钟，终止脱颗粒反应。
注意： 如有需要，可在4 °C暂停此步骤，暂停时间为30–45分钟。

4. 红细胞裂解

向每支试管中加入 2 mL 1x 裂解缓冲液以裂解红细胞。涡旋混匀每支试管，并在室温下孵育 5 分钟。
注意： 此步骤中，由于缓冲液含有固定剂（甲醛），细胞会被固定。
在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。将上清液倾倒至水槽中，试管架倒置。细胞将保留在试管底部。
向每支试管中加入 3 mL PBS-T 洗涤细胞。涡旋混匀每支试管。
在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。将上清液倾倒至水槽中，试管架倒置。
注意： 样品需在 4 °C 避光保存，直至进行流式细胞仪检测。

5. 流式细胞术数据采集

使用流式细胞仪（例如，BD FACSCalibur 流式细胞仪）获取样本。将流式细胞仪连接至计算机软件，并等待仪器准备就绪。加载模板和仪器设置（表 1）。
开始样本采集。
采用以下流式细胞仪分析策略筛选活化嗜碱性粒细胞。
1. 在侧向散射（SSC）— 前向散射（FSC）图中圈选淋巴细胞群。
2. 从淋巴细胞群体中圈选 CCR3⁺CD203c⁺ 细胞作为嗜碱性粒细胞。每管至少采集 500 个嗜碱性粒细胞。
3. 展示 CCR3—CD63 图，以 CD63 作为活化标志物分析细胞活化情况。利用阴性对照管将 CD63 阴性阈值设定为约 2.5%。
4. 采集所有样本。

表1：流式细胞仪要求

光源（激光器）	488 nm Coherent SapphireTM 风冷式氩离子激光器；20 mW；633 nm JDS UniphaseTM HeNe 风冷激光器；17 mW
激发光波长	蓝色激光：488 nm；红色激光：633 nm
激发波长下的光源功率	蓝色激光：20 mW；红色激光：17 mW
光学滤光片	SSC：488/10；FITC：530/30；PE：585/42；APC：660/20
光学检测器	FSC、SSC、FL1-H FITC、FL2-H PE、FL4-H APC
光学检测器类型	风冷式氩离子激光器
光路	BD 八边形（488 nm 激光线）；BD 三角形（633 nm 激光线）

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