使用流式细胞术分析测试变应原存在下的嗜碱性粒细胞活化

摘要

来源：Doña, I. 等，用于过敏诊断的嗜碱性粒细胞活化试验。视觉化实验杂志（2021）

在本视频中，我们演示了使用流式细胞术检测在试验性变应原存在下嗜碱性粒细胞活化的方法。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 样品制备

1. 在9 mL肝素抗凝管中采集外周血，并将样本置于室温（RT）下旋转器中保存，直至实验方案需要时使用。
2. 标记5 mL流式管用于阴性对照（2管）、阳性对照（2管）以及不同浓度的过敏原/药物（每种过敏原/药物浓度各1管）。将流式管放置在管架中，确保管子稳固不滑动。
3. 在双蒸水中配制刺激缓冲液，其中包含2%（v/v）HEPES、78 mg/L NaCl、3.7 mg/L KCl、7.8 mg/L CaCl₂、3.3 mg/L MgCl₂、1 g/L HSA。调节pH至7.4，并加入IL-3至终浓度2 ng/mL。通常配制100 mL，分装为每份2.5 mL，于-20 °C冷冻保存。
4. 在含0.05%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）中配制阳性对照：阳性对照1为N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）（4 µM），用于确认嗜碱性粒细胞的质量；阳性对照2为抗IgE抗体（0.05 mg/mL），作为IgE介导的阳性对照。
5. 在PBS-T中配制过敏原/药物，浓度为所需终浓度的2倍。
   注意：应通过广泛浓度梯度、剂量-反应曲线以及按照相同实验步骤进行....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 圆底聚苯乙烯试管，无盖，非无菌	Corning	352008
APC 抗人 CD193 (CCR3) 抗体	BioLegend	310708
BD FACSCalibur 流式细胞仪	BD Biosciences
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
FITC 抗人 CD63 抗体	BioLegend	353006
HEPES (1 M)	Thermo-Fisher	15630106
溶血溶液，10 倍浓缩	BD Biosciences	349202
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸	Sigma-Aldrich	F3506
PE 抗人 CD203c (E-NPP3) 抗体	BioLegend	324606
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
纯化小鼠抗人 IgE	BD Biosciences	555857
重组人 IL-3	R&D Systems	203-IL
鞘液	BD Biosciences	342003
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
9 mL LH 锂肝素试管	Greiner Bio-One	455084
吐温 20	Sigma-Aldrich	P1379