基于光转化的细菌感染转基因斑马鱼中白细胞追踪

摘要

来源：Harvie, E. A. 等人 斑马鱼幼体先天免疫反应模型中的非侵入性成像 Streptococcus iniae 感染。 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了利用表达光可转换绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼鱼追踪白细胞募集的过程。通过将红色荧光染料标记的细菌预先注射到内耳囊中并诱导光转换，可观察白细胞在体内的迁移、吞噬及扩散过程，从而深入了解免疫反应动态。

方案

1. 准备显微注射针

1. 使用显微拉针仪制备薄壁玻璃毛细管注射针（外径1.0，内径0.75），仪器参数设置如下：气压200，加热502，拉力90，速度80，时间70，拉制开始时气压作用时间5，拉制结束时气压作用时间5。
2. 使用精细镊子折断拉制后针尖，使针尖开口直径约为10 µm。

2. 准备幼虫注射培养皿

1. 用无菌水冲洗宽度约为 4-5 mm 的凝胶梳，然后使其自然干燥。
2. 在 E3 培养基中配制 1.5-2% 的高熔点琼脂糖溶液，微波加热至溶液澄清。待冷却后，将部分琼脂糖倒入培养皿（100 × 15 mm）中，轻轻旋转，加入适量琼脂糖以完全覆盖皿底。
3. 待琼脂糖层凝固后，将已冲洗并干燥的凝胶梳放置其上，使无齿端轻轻搭在培养皿边缘，有齿端接触琼脂糖表面。确保梳子尽可能保持水平，与底部琼脂糖层形成约 30° 的夹角。
4. 在梳子与底部琼脂糖层交界处再倒入少量新鲜琼脂糖，使新层覆盖梳子的加样孔。待其完全冷却后取出梳子，并用移液器吸头去除加样孔中悬垂的琼脂糖碎片。
5. 在注射模具表面加入 E3 培养基，并于 4 °C 保存。
6. 每次使用前，更换新鲜培养基，并在注射前于 28.5 °C 预热注射斜面至少 1 小时。
7. 注射前立即用含有 200 µg/mL 乙基-3-氨基苯甲酸酯（三卡因）的 E3 培养基替换注射斜面上的 E3 培养基。

3. 制备海豚链球菌（S. iniae）接种物

1. 制备并高压灭菌添加了0.2%酵母提取物和2%蛋白胨的Todd Hewitt肉汤培养基（THY+P）：每升含30 g Todd Hewitt、2 g酵母提取物、20 g蛋白胨。若制备琼脂平板，加入14 g/L琼脂。
2. 在感染实验前一晚，将100 µl冷冻菌种加入装有10 ml THY+P肉汤的密封15 ml离心管中，用移液器吹打混匀。于37 °C静置培养过夜。经过14–16小时生长后，使用该过夜培养物制备冻存菌种或用于注射实验。
3. 制备冻存菌种时，取1 ml过夜培养物与500 µl 80%甘油混合，置于1.7 ml离心管中。为避免反复冻融，将此混合液分装为每管100 µl的单次使用 aliquot，并于-80 °C保存。
4. 用于感染实验的S. iniae，需将过夜培养物按1:100比例稀释，总体积为10 ml，即取0.1 ml过夜培养物加入9.9 ml THY+P肉汤中。于37 °C静置培养约4–5小时。使用Nanodrop分光光度计监测600 nm处的光密度（OD），当OD600 nm达到0.250–0.500时，在对数生长期中期收获细菌。OD600 nm为0.250时，相当于约10⁸菌落形成单位（CFU）/ml。
5. 取1 ml细菌培养物于1.7 ml离心管中，在1,500 x g条件下离心5分钟以收集菌体。用1 ml新鲜磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，重复一次。测定PBS中细菌的OD600 nm值，离心后重悬于PBS中，调整至所需浓度。
6. 为便于显微注射时观察，可在注射前向细菌悬液中加入酚红，使其终浓度为0.1%。
7. 对于需注射热灭活细菌的实验，将细菌在PBS中于95 °C加热30分钟。通过将注射体积（约1 nl）涂布于固体THY+P琼脂平板并在37 °C过夜培养，确认热灭活处理已将活菌数量降至无法检测水平。

4. 使用 CellTracker 红色荧光染料标记S. iniae

1. 为标记活体细菌细胞，需配制一种CellTracker荧光染料或等效产品的储存液。由于所用染料为每管20 x 50 µg的粉末形式，需用二甲基亚砜（DMSO）重悬，向管中加入7.3 µl DMSO，以获得10 mM的储存液浓度。
2. 测试一系列染料浓度（例如， 0.5–25 µM）处理细菌，以确定可有效染色细胞的最低最适浓度。分裂迅速的细胞或较长时间的实验可能需要更高浓度的染料。
   1. 在1.7 ml离心管中取1.0 ml细菌培养物，按上述方法（第3节）离心收集菌体。用1 ml新鲜PBS重悬菌体沉淀，并向细菌悬液中加入适量染料。
   2. 37 °C下静置孵育30分钟。离心收集菌体，重悬于1 ml预热的THY+P培养基中，于37 °C继续静置孵育30分钟。
   3. 离心收集细菌，并用PBS洗涤两次，然后按上述（第3节）方法测定OD600 nm值，并将细菌稀释至适合显微注射的浓度。在白细胞募集和吞噬作用研究中，我们通常在1 nl注射体积中注射约100 CFU。

5. 感染用斑马鱼幼鱼的制备

1. 前一晚设置交配对，并按照Rosen所述方法收集胚胎 等 将胚胎置于E3培养基中，在28.5 °C条件下孵育至感染所需阶段。
2. 对于需要成像的斑马鱼，在受精后24小时（hpf）向E3培养基中加入N-苯硫脲（PTU），终浓度为0.2 nM，以抑制色素（黑色素化）的发育。
3. 对于受精后2天（dpf）的胚胎感染实验，可使用精细镊子手动去除胚胎的卵膜。或者，通过移除E3培养基并加入蛋白酶（pronase，2 mg/ml）处理约5分钟，直至轻柔吹打即可使胚胎脱离卵膜。大多数幼鱼在3 dpf时应已自然孵化。
4. 在感染前数分钟，将去壳的幼鱼放入含有 200 µg/ml 三卡因的 E3 培养基中以麻醉斑马鱼。

6. 向三天龄幼鱼的耳囊注射 S. iniae

1. 打开显微注射仪，并将时间范围设置为“毫秒”。打开二氧化碳气罐的阀门，使气体进入管路。显微注射仪的压力应显示约为20磅每平方英寸（PSI）。通过顺时针旋转黑色滚花旋钮以增加压力，或逆时针旋转以降低显微注射仪单元内的压力。
2. 涡旋混匀已制备的 S. iniae 在酚红和PBS中培养，并使用微加载吸头将2-3 µl培养物加入拉制的毛细管注射针中。
3. 将装好样品的针头安装在连接磁性支架的显微操作器上，并置于体视显微镜下，使针头与显微镜底座呈约45–65°角。
4. 踩下显微注射仪的脚踏板，将一滴接种物释放到针尖上。使用显微镜目镜中的标尺测量液滴的直径。
   1. 或者，可通过将一定体积的液体注入置于带刻度尺的玻璃显微镜载片上的矿物油滴中，以估算液滴的直径。液滴直径应约为0.10 mm，相当于约1 nl的体积。
   2. 通过调节显微注射仪的持续时间设置，或使用精细镊子剪去更多针尖部分来调整液滴大小。注意注射时间应控制在20–35毫秒之间，以避免造成过大的组织损伤。
5. 使用塑料移液管将12条麻醉后的幼虫转移至注射模具的每个孔中。
6. 使用玻璃棒、毛环或塑料吸头轻轻调整幼鱼位置，使头部朝向显微镜后方，卵黄囊位于孔板的左侧。将幼鱼的左耳朝上指向天花板。
7. 通过体视显微镜的目镜观察，使用显微操作仪上的旋钮将装有样品的针尖与耳泡对齐，使二者处于同一视野范围内。用针尖刺穿耳泡的外层上皮，使针尖刚好进入耳泡内部。
8. 踩下脚踏板，注入所需剂量的1 nl溶液 S. iniae确保使用足够低的压力，以免腔体破裂。如果注射成功，耳泡会充满酚红接种液，而周围组织则不会被填充。图1 Ai立即从注射板中移除任何注射失败的鱼。
9. 小心地将针头从幼虫体内抽出，手动移动注射载板，使下一只幼虫进入视野。此操作在5倍放大倍数下进行。
   注意： 针头回撤可能导致部分细菌沉积在耳囊外，从而影响存活率和白细胞募集结果的准确性。为避免此问题，建议注射荧光染料标记的细菌，并在荧光显微镜下对注射后的幼鱼进行直观观察，剔除发生此类情况的个体。正确注射的幼鱼如（图1 Bi).
10. 为确保整个实验过程中注射体积/接种量保持一致，每间隔48小时后，将一滴细菌悬液注入含有100 µl无菌PBS的1.7 ml离心管中^th 胚胎。将100 µl接种于THY+P琼脂平板上，37 °C过夜培养，以测定注射体积中的菌落形成单位（CFU）。
11. 当注射斜面上全部12只幼虫完成注射后，小心使用塑料移液管将幼虫从孔中取出，并转移至新的培养皿（35 × 10 mm）中²). 移除三卡因溶液，并加入约 2 ml 新鲜 E3 培养基，使幼鱼恢复。
12. 用移液器将幼虫注入96孔板的单个孔中，于28.5 °C培养。在培养过程中定期观察各孔中幼虫的存活情况，或在后续时间点取出幼虫用于成像或CFU计数。

7. 用于成像的幼虫固定

1. 按照第7节所述，用冰冷的4%多聚甲醛PBS溶液固定幼虫。
2. 室温下用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后进行成像。

8. 活体成像用幼虫的制备

1. 在微波炉中加热E3中的1.5%低熔点琼脂糖溶液，直至溶液变澄清。
2. 将琼脂糖溶液放入55 °C水浴中冷却，使其保持液态但温度降低。
3. 向琼脂糖溶液中加入三卡因，使其终浓度为0.016%。
4. 使用塑料移液管，将4-5条麻醉后的幼鱼转移至置于体视显微镜载物台上的玻璃底培养皿中。
5. 将装有琼脂糖的容器从55 °C水浴中取出，在室温下冷却1-2分钟。在琼脂糖冷却的同时，尽可能吸除麻醉后幼鱼周围的液体。
6. 将冷却后的琼脂糖倒入培养皿中，覆盖约一半的表面区域，轻轻旋转培养皿以均匀铺展琼脂糖。注意：若琼脂糖温度过高，会杀死幼鱼；若加入过多琼脂糖，显微镜物镜在透过琼脂糖聚焦时可能会触碰到培养皿底部。
7. 使用移液管吸取漂浮至培养皿边缘的幼鱼，并将其重新转移至培养皿中央。
8. 在体视显微镜下，使用毛发环、长移液枪头或玻璃棒轻轻调整幼鱼的位置至所需方向。若需成像耳囊结构，应将幼鱼调整至左侧耳囊紧贴培养皿底部的位置。
9. 在移动培养皿前，让琼脂糖冷却约10分钟。若琼脂糖尚未完全凝固，幼鱼可能发生位移。可轻轻在琼脂糖层上方滴加一些含三卡因的E3溶液，以保持其湿润。

9. 感染的共聚焦成像

1. 将带有幼虫的玻璃底培养皿放置在配备 FV-1000 激光扫描共聚焦系统的倒置显微镜载物台上。
2. 将针孔设为200–300 µm，使用数值孔径0.75/20X物镜，设置z轴层扫，层厚为3–6 µm。
3. 使用连续线扫描为每个通道调整激光功率和探测器增益。
4. 使用每个荧光通道的连续线扫描例如， 使用488 nm和543 nm激光及微分干涉差显微镜（DIC），每隔3分钟对左侧耳囊进行一次延时成像，持续2至6小时，以观察中性粒细胞和巨噬细胞的初始募集及吞噬作用。对于更长时间的成像，需在培养皿上加盖，以防止琼脂糖蒸发干燥。
5. 获取固定样本的静态图像（图1B）或活体（图2在20倍或40倍放大倍数下观察幼虫。

10. 在耳泡处对Dendra2标记的白细胞进行光转化

注意：Dendra2 可通过将 405 nm 激光（50–70% 激光功率通常足够）聚焦于感兴趣区域（ROI）1 分钟，实现从绿色荧光到红色荧光的光转化。以下是用于 FV-1000 激光扫描共聚焦系统的逐步操作方案：

1. 使用488 nm和543 nm激光通过z轴扫描观察样品。采用连续线扫描方式调节激光功率和探测器增益。检查以确保没有意外的红色荧光光转化。
2. 在“图像采集控制”窗口的“刺激设置”下选择“使用扫描仪”工具，并选择“主通道”。选择405 nm激光并将功率设置为70%。使用圆形选项，在耳囊中定义感兴趣区域（ROI）。
3. 在“刺激启动设置”下选择“序列激活”，预激活1帧，激活时间为60,000毫秒。在“采集设置”窗口的“时间扫描”标题下，选择2个时间间隔，每个为00:01:00（分别用于光转化前和光转化后）。
   注意：完成延时扫描序列后，Dendra2应已光转化为其红色荧光状态。
4. 使用488 nm和543 nm激光对样品进行z轴扫描，以观察已光转化的红色荧光以及任何残留的绿色荧光（图3）。

结果

图1：白细胞向耳囊感染部位的募集 S. iniae. (A中性粒细胞募集至 S. iniae 感染。i) 成功将酚红标记的接种物注射到耳泡中。ii-四幼虫苏丹黑染色以检测2小时感染后中性粒细胞的募集情况。PBS模拟感染的幼虫显示中性粒细胞向耳囊的募集极少（ii）而感染任一野生型 S. iniae...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 ml 离心管	MidSci	AVSS1700
14 ml 离心管	BD Falcon	352059
96孔板	康宁公司	3596
琼脂	BD 生物科学	214030
CellTracker 红色染料	分子探针，英吉瑞	C34552
CNA 琼脂	Dot Scientific公司	7126A
一次性移液管	Fisher Scientific	13-711-7m
解剖范围	尼康	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
精细镊子	Fine Science Tools	11251-20
凝胶梳	VWR	27372-482	4.2 mm 宽，1.5 mm 厚
玻璃底培养皿			在35 mm细胞培养皿底部中央钻一个16–18 mm的孔，将一块22 mm圆形#1盖玻片置于孔中，并用一层Norland光学胶68密封，再通过紫外光固化。
甘油	Fisher Scientific	G33-4
高熔点琼脂糖	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	使用 FV-1000 系统
低熔点琼脂糖	Fisher	BP165-25
磁力架	Narishige（Narishige）	GJ-1
显微注射系统	Parker	Picospritzer III
微量移液器吸头	Eppendorf	930001007
显微操作仪	Narishige（Narishige）	M-152
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Company	弗拉明/布朗 P-97
Nanodrop 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-1000
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629
甲醛	电子显微镜科学公司	15710
培养皿	Fisher Scientific	FB0875712	100 mm × 15 mm
酚红	Ricca Chemical Company	572516
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP665-1
Pronase	罗氏	165921
蛋白酶蛋白胨	Fluka Biochemika	29185
小型细胞培养皿	康宁公司	430165	35 mm × 10 mm
薄壁玻璃毛细管注射针	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
托德·休伊特	Sigma Aldrich/Fluka 分析试剂	T1438
三卡因（Tricaine，乙基-3-氨基苯甲酸酯）	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
酵母提取物	Fluka Biochemika	92144