细菌感染的转基因斑马鱼中基于光转化的白细胞追踪

摘要

来源:Harvie， E. A. et al.， 链球菌感染斑马鱼幼虫模型中先天免疫反应的无创成像。J. Vis. Exp. （2015 年）

该视频演示了使用表达光转化绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼虫追踪白细胞募集。将红色荧光染料标记的细菌预先注射到耳囊泡中并诱导光转化，可以观察白细胞的迁移、吞噬作用和在全身的扩散，为免疫反应动力学提供有价值的见解。

方案

1. 准备显微注射针

1. 使用微量移液器拉拔装置准备薄壁玻璃毛细管注射针 （1.0 OD/0.75 ID），设置如下:气压 200、加热 502、拉力 90、速度 80、时间 70、拉动 5 开始时的空气时间、拉动 5 结束时的空气时间。
2. 使用细镊子折断拉出的针尖，使针尖开口的直径约为 10 μm。

2. 准备幼虫注射皿

1. 用无菌水冲洗泳道宽度约为 4-5 mm 的凝胶梳，然后晾干。
2. 在 E3 培养基中制备 1.5-2% 高熔点琼脂糖溶液，然后微波直至溶液澄清。冷却后，将一些琼脂糖倒入培养皿 （100 x 15 mm） 中并旋转，加入刚好足够的琼脂糖以完全覆盖培养皿底部。
3. 琼脂糖层凝固后，将冲洗并干燥的凝胶梳放在顶部，使未梳理的一端刚好放在培养皿的顶部，而梳理的一端接触琼脂糖。确保梳子尽可能水平，相对于底部琼脂糖层形成 30° 角。
在
4. 电泳梳和底部琼脂糖层之间的界面处再倒入少量琼脂糖，使新鲜的琼脂糖层覆盖电泳梳的孔。在取下梳子之前让其完全冷却。使用移液管吸头，从孔中取出任何悬垂的琼脂糖碎片。
5. 将 E3 培养基倒在注塑模具顶部并储存在 4 °C。
6. 每次使用前，更换为新鲜培养基，并在注射前至少 28.5 °C 的温热注射液升温 1 小时。
7. 在进样前，用含有 200 μg/ml 3-氨基苯甲酸乙酯（三卡因）的 E3 培养基替换进样斜坡上的 E3。

3. 准备 Streptococcus iniae （S. iniae） 接种物

1. 准备并高压灭菌补充有 0.2% 酵母提取物和 2% 蛋白胨 （THY+P） 的 Todd Hewitt 肉汤培养基:30 g/L Todd Hewitt、2 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨。对于琼脂平板，添加 14 g/L 琼脂。
在
2. 感染前一晚，通过将 100 μl 等分试样的冷冻细菌原液移液到密封的 15 ml 试管中的 10 ml THY+P 肉汤中，制备细菌培养物。在 37 °C 下孵育过夜，无需搅拌。生长 14-16 小时后，使用过夜培养物制备冷冻原液或准备用于注射。
3. 通过将 1 ml 过夜培养物放入 1.7 ml 离心管中的 500 μl 80% 甘油中来制备冷冻原液。为避免冻融循环，从该混合物中制备 100 μl 一次性等分试样并储存在 -80 °C。
4. 对于用于感染的 S. iniae，通过将 0.1 ml 过夜培养物添加到 9.9 ml THY + P 肉汤中，以 1:100 稀释过夜培养物，得到 10 ml 培养物的总体积。在 37 °C 下生长约 4-5 小时，无需搅拌。使用 Nanodrop 分光光度计监测 600 nm 处的光密度 （OD），并在 OD 600 nm 达到 0.250-0.500 时在中对数阶段收获细菌。0.250 的 OD 600 nm 对应于大约 10⁸ 个菌落形成单位 （CFU）/ml。
在
5. 1.7 ml 离心管中以 1,500 x g 的离心力沉淀 1 ml 细菌培养物 5 分钟。重悬于 1 ml 新鲜磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中并重复。测量 PBS 中细菌的 OD 600 nm，沉淀，并在 PBS 中重悬以达到所需的浓度。
6. 为了帮助显微注射的可视化，在注射前将酚红添加到细菌悬浮液中，终浓度为 0.1%。
7. 对于涉及注射热灭活细菌的实验，将细菌在PBS中于95°C加热30分钟。通过在固体THY + P琼脂平板上铺板注射体积（约1 nl）并在37°C下孵育过夜，确认热灭活过程将活细菌的数量减少到无法检测的水平。

4. 用 CellTracker Red 荧光染料标记 S. iniae

1. 要标记活细菌细胞，请制备 CellTracker 荧光染料或等效物的储备液。由于使用的染料为 20 x 50 μg 等分试样粉末，并且需要重悬于二甲基亚砜 （DMSO） 中，因此向试管中加入 7.3 μl DMSO 以获得 10 mM 储备液浓度。
2. 在细菌上测试一系列染料浓度（例如，0.5-25 μM），以确定对细胞进行染色的最低最佳浓度。快速分裂的细胞和较长的实验可能需要更高浓度的染料。
   1. 如上所述，通过离心在 1.7 ml 管中沉淀 1.0 ml 细菌培养物（第 3 节）。将沉淀重悬于 1 ml 新鲜 PBS 中，并向细菌培养物中加入适当体积的染料。
   在
   2. 37 °C 下不搅拌孵育 30 分钟。旋转细菌并重悬于 1 ml 预热的 THY+P 肉汤中，并在 37 °C 下不搅拌再孵育 30 分钟。
   3. 离心细菌并在 PBS 中洗涤两次，然后测量 OD 600 nm 并如上所述稀释细菌以进行显微注射（第 3 节）。我们通常在 1 nl 注射体积中注射大约 100 CFU，用于白细胞募集和吞噬作用的研究。

5. 斑马鱼幼虫感染的准备

1. 在前一天晚上设置繁殖配对并按照 Rosen 等人的描述收集胚胎。在 28.5 °C 的 E3 培养基中孵育胚胎，直至准备好感染。
2. 对于将要成像的斑马鱼，通过在受精后 24 小时 （hpf） 向 E3 培养基中添加 N-苯硫脲 （PTU） 来防止色素的形成（黑色素化），最终浓度为 0.2 nM。
3. 对于涉及受精后 2 天龄胚胎 （dpf） 的感染，用一对细镊子手动去除胚胎。或者，通过去除 E3 并用链霉蛋白酶 （2 mg/ml） 替换胚胎约 5 分钟或直到轻轻移液将胚胎从绒毛膜中分离出来，使胚胎去绒毛膜。大多数幼虫应该在 3 dpf 时自然孵化。
4. 通过将去除的幼虫放入含有 200 μg/ml 三卡因的 E3 培养基中，在感染前几分钟麻醉斑马鱼。

6. 将 S. iniae 耳囊注射到 3 日龄幼虫中

1. 打开显微注射器并将时间范围设置为 "毫秒"。打开二氧化碳罐上的阀门，让气体进入管线。显微注射器的压力读数应约为 20 磅/平方英寸 （PSI）。通过顺时针转动黑色滚花旋钮以增加压力或逆时针转动以降低压力来调节显微注射器装置中的压力。
2. 在酚红和 PBS 中涡旋制备的 S. iniae 培养物，并使用微量加载器尖端将 2-3 μl 培养物加载到拉动的毛细管注射针中。
3. 将加载的针头安装在连接到磁力架的显微纵器上，并将其放置在立体显微镜下，使针头相对于显微镜底座呈大约 45-65° 角。
4. 踩下显微注射器的脚踏板，将一滴接种物分配到针尖上。使用显微镜目镜中的比例尺测量液滴的直径。
   1. 或者，通过在带有比例尺的玻璃显微镜载玻片上将体积注入一滴矿物油来估计液滴的直径。液滴的直径应约为 0.10 mm，约为 1 nl 体积。
   2. 通过调整显微注射器上的持续时间设置或用细镊子剪掉更多的针尖来调整液滴大小。请注意，注射时间应在 20 - 35 毫秒之间，以避免造成过多的组织损伤。
5. 使用塑料移液管，将 12 只麻醉的幼虫转移到注射模具的每个孔中。
6. 使用玻璃棒、毛圈或塑料尖端轻轻定位幼虫，使头部指向显微镜的背面，卵黄囊靠在孔的左侧。将幼虫的左耳向上指向天花板。
7. 通过立体显微镜的目镜观察，使用显微作器上的旋钮将加载的针头与耳囊对齐，使两者处于同一视野中。用针尖刺穿耳囊的外上皮层，使针尖刚好在囊泡内。
8. 踩下脚踏板，注射 1 nl 所需剂量的 S. iniae。请务必使用足够低的压力，以免空腔破裂。如果注射成功，耳囊，而不是周围组织，应充满酚红接种物（图 1 Ai）。立即从注射板中取出任何错误注射的鱼。
9. 小心地将针头从幼虫中缩出，并用手移动注射板，以便看到下一个幼虫。在 5 倍放大倍率下执行此作。
   注意:针头缩回可能导致一些细菌沉积在耳囊外，这可能会扭曲存活率和白细胞募集结果。为避免这种情况，建议注射荧光染料标记的细菌，并在荧光显微镜下目视扫描注射的幼虫，以去除发生这种情况的任何幼虫。正确注射的幼虫如（图 1 Bi）所示。
10. 为确保注射体积/接种物在实验过程中保持不变，在每 48^个胚胎后，将一滴细菌悬浮液注入含有 100 μl 无菌 PBS 的 1.7 ml 离心管中。将 100 μl 接种在 THY + P 琼脂平板上，在 37 °C 下过夜，以确定注射体积中的 CFU。
11. 当注射斜坡上的整组 12 只幼虫被注射后，小心地使用塑料移液管从孔中取出幼虫并将它们放入新的培养皿 （35 x 10 mm²） 中。去除三卡因溶液，用大约 2 ml 新鲜的 E3 培养基替换，以使幼虫恢复。
12. 将幼虫移液管注射到 96 孔板的单孔中，并在 28.5 °C 下孵育。随着时间的推移监测幼虫在这些板中的存活情况，或稍后将其取出以进行成像或 CFU 计数。

7. 固定幼虫进行成像

1. 如第 7 节所述，将幼虫固定在冰冷的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中。
2. 在室温下，成像前在 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。

8. 用于实时成像的幼虫的制备

通过在
1. 微波炉中加热至 溶液澄清，在 E3 中制备 1.5% 低熔点琼脂糖溶液。
2. 将琼脂糖溶液置于 55 °C 水浴中，使其冷却但不硬化。
3. 向琼脂糖中加入三卡因至终浓度为 0.016%。
4. 使用塑料移液管，将 4-5 只麻醉的幼虫放在立体显微镜载物台上的玻璃底培养皿中。
5. 从 55 °C 水浴中取出三卡因和琼脂糖溶液，并在室温下冷却 1-2 分钟。当琼脂糖冷却时，从麻醉的幼虫中去除尽可能多的液体。
6. 将冷却的琼脂糖倒入培养皿中，直到覆盖大约一半的表面。旋转培养皿以铺开琼脂糖。请注意，如果琼脂糖太热，它会杀死幼虫。此外，如果向培养皿中加入过多的琼脂糖，则通过琼脂糖聚焦时，显微镜的物镜可能会撞到培养皿的底部。
7. 使用移液管，拾取漂浮到培养皿侧面的幼虫，然后将它们移回中心。
8. 在立体显微镜下，根据需要用毛环、长移液器吸头或玻璃棒轻轻定位幼虫。对于耳囊的成像，放置幼虫，使左侧耳囊泡平靠培养皿底部。
9. 让琼脂糖冷却约 10 分钟，然后移动培养皿。如果琼脂糖不是固体，幼虫可能会改变位置。轻轻吸取一些三卡因和 E3 溶液到琼脂糖层的顶部，以保持其湿润。

9. 感染的共聚焦成像

1. 将装有幼虫的玻璃底培养皿放在带有 FV-1000 激光扫描共聚焦系统的倒置显微镜的载物台上。
2. 将针孔设置为 200-300 μm，并使用数值孔径 0.75/20X 物镜，将 z 堆栈设置为 3-6 μm 切片。
3. 使用连续线扫描来调整每个通道的激光功率和探测器增益。
4. 对每个荧光通道（例如，488 和 543 nm）和微分干涉对比 （DIC） 进行顺序线扫描，每 3 分钟对左耳囊泡进行延时拍摄，持续 2-6 小时，以观察中性粒细胞和巨噬细胞的初始募集和吞噬作用。对于更长的疗程，请在培养皿上盖上盖子，以防止琼脂糖蒸发和干燥。
5. 以 20 倍或 40 倍放大倍率获取固定（图 1B）或活（图 2）幼虫的静止图像。

10. Dendra2 标记的耳囊白细胞的光转化

注意:通过将 405 nm 激光器（50-70% 的激光功率就足够了）聚焦在感兴趣区域 （ROI） 上 1 分钟，Dendra2 可以从绿色荧光光转化为红色荧光。以下是用于 FV-1000 激光扫描共聚焦系统的分步方案:

1. 使用 488 nm 和 543 nm 激光器的 z 堆栈扫描可视化样品。使用连续线扫描来调整激光功率和探测器增益。检查以确保没有意外的光转化红色荧光。
2. 在 "Image Acquisition Control" 窗口的 "Stimulus Setting" 下选择 "Use Scanner" 工具，然后选择 "Main"。选择 405 nm 激光器并将其设置为 70% 的功率。使用圆圈选项，定义耳囊中的 ROI。
3. 在"Stimulus Start Setting"下，选择"Activation in series"，预激活为 1 帧，激活时间为 60,000 毫秒。在"Time Scan heading"下的 "Acquisition Setting" 窗口中，选择 00:01:00 的 2 个间隔（一个用于光转换前，一个用于光转换后）
   注意:延时系列扫描完成后，Dendra2 应该已经被光转换为其红色荧光状态。
4. 使用 488 nm 和 543 nm 激光器通过 z 堆栈扫描样品，以可视化光转换的红色荧光以及任何剩余的绿色荧光（图 3）。

结果

图 1:白细胞募集到 S. iniae 耳囊感染。（A） 中性粒细胞募集到 S. iniae 感染。（i） 将酚红标记的接种物成功注射到耳囊中。（二至四）幼虫苏丹黑染色，用于研究 2 hpi 时的中性粒细胞募集。PBS 模拟感染的幼虫显示中性粒细胞很少募集到耳囊 （ii），而野生型 S. iniae 或 cpsA 突变体感染会导致强大的中性粒细胞募集 （iii， iv）。比例尺，300 μm。（B） 巨噬细胞募集到 S. iniae 感染。（

材料