基于光转化的细菌感染转基因斑马鱼中白细胞追踪

摘要

来源：Harvie, E. A. 等人 斑马鱼幼体先天免疫反应模型中的非侵入性成像 Streptococcus iniae 感染。 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了利用表达光可转换绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼鱼追踪白细胞募集的过程。通过将红色荧光染料标记的细菌预先注射到内耳囊中并诱导光转换，可观察白细胞在体内的迁移、吞噬及扩散过程，从而深入了解免疫反应动态。

方案

1. 准备显微注射针

1. 使用显微拉针仪制备薄壁玻璃毛细管注射针（外径1.0，内径0.75），仪器参数设置如下：气压200，加热502，拉力90，速度80，时间70，拉制开始时气压作用时间5，拉制结束时气压作用时间5。
2. 使用精细镊子折断拉制后针尖，使针尖开口直径约为10 µm。

2. 准备幼虫注射培养皿

1. 用无菌水冲洗宽度约为 4-5 mm 的凝胶梳，然后使其自然干燥。
2. 在 E3 培养基中配制 1.5-2% 的高熔点琼脂糖溶液，微波加热至溶液澄清。待冷却后，将部分琼脂糖倒入培养皿（100 × 15 mm）中，轻轻旋转，加入适量琼脂糖以完全覆盖皿底。
3. 待琼脂糖层凝固后，将已冲洗并干燥的凝胶梳放置其上，使无齿端轻轻搭在培养皿边缘，有齿端接触琼脂糖表面。确保梳子尽可能保持水平，与底部琼脂糖层形成约 30° 的夹角。
4. 在梳子与底部琼脂糖层交界处再倒入少量新鲜琼脂糖，使新层覆盖梳子的加样孔。待其完全冷却后取出梳子，并用移液器吸头去除加样孔中悬垂的琼脂糖碎片。
5. 在注射模具表面加入 E3 培养基，并于 4 °C 保存。
6. 每次使用前，更换新鲜培养基，并在注射前于 28.5 °C 预热注射斜面至少 1 小时。
7. 注射前立即用含有 200....

结果

图1：白细胞向耳囊感染部位的募集 S. iniae. (A中性粒细胞募集至 S. iniae 感染。i) 成功将酚红标记的接种物注射到耳泡中。ii-四幼虫苏丹黑染色以检测2小时感染后中性粒细胞的募集情况。PBS模拟感染的幼虫显示中性粒细胞向耳囊的募集极少（ii）而感染任一野生型 S. iniae.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 ml 离心管	MidSci	AVSS1700
14 ml 离心管	BD Falcon	352059
96孔板	康宁公司	3596
琼脂	BD 生物科学	214030
CellTracker 红色染料	分子探针，英吉瑞	C34552
CNA 琼脂	Dot Scientific公司	7126A
一次性移液管	Fisher Scientific	13-711-7m
解剖范围	尼康	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
精细镊子	Fine Science Tools	11251-20
凝胶梳	VWR	27372-482	4.2 mm 宽，1.5 mm 厚
玻璃底培养皿			在35 mm细胞培养皿底部中央钻一个16–18 mm的孔，将一块22 mm圆形#1盖玻片置于孔中，并用一层Norland光学胶68密封，再通过紫外光固化。
甘油	Fisher Scientific	G33-4
高熔点琼脂糖	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	使用 FV-1000 系统
低熔点琼脂糖	Fisher	BP165-25
磁力架	Narishige（Narishige）	GJ-1
显微注射系统	Parker	Picospritzer III
微量移液器吸头	Eppendorf	930001007
显微操作仪	Narishige（Narishige）	M-152
微移液管拉制仪	Sutter Instrument Company	弗拉明/布朗 P-97
Nanodrop 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-1000
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629
甲醛	电子显微镜科学公司	15710
培养皿	Fisher Scientific	FB0875712	100 mm × 15 mm
酚红	Ricca Chemical Company	572516
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP665-1
Pronase	罗氏	165921
蛋白酶蛋白胨	Fluka Biochemika	29185
小型细胞培养皿	康宁公司	430165	35 mm × 10 mm
薄壁玻璃毛细管注射针	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
托德·休伊特	Sigma Aldrich/Fluka 分析试剂	T1438
三卡因（Tricaine，乙基-3-氨基苯甲酸酯）	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
酵母提取物	Fluka Biochemika	92144