三维定量相位成像用于表征淋巴细胞亚型

摘要

来源：Yoon, J. 等。利用三维定量相位成像与机器学习无标记识别淋巴细胞亚型。J. Vis. Exp.  (2018)

本视频通过三维定量相位成像技术，展示了无需标记即可识别淋巴细胞形态与生化特性的方法。该技术可对淋巴细胞进行深入分析，揭示其内部结构与特性，无需依赖标记步骤。

方案

1. 淋巴细胞亚群的流式细胞术分析与分选

注意：根据细胞类型分选淋巴细胞对于建立真实值（ground-truth）至关重要即， 正确的细胞类型标签用于在有监督学习中训练和测试细胞类型分类器。流式细胞术作为一种金标准方法，用于鉴定和分离淋巴细胞。

1. 在 100 µL 新鲜 RPMI-1640 培养基 [含 10% FBS、0.1 µg CD3e (17A2)、CD8a (53-6.7)、CD19 (1D3)、CD45R (B220, RA3-6B2) 和 NK1.1 (PK136)] 中配制表面标志物染色抗体混合液，并加入 0.25 µg CD4 (GK1.5) 抗体，用于标记 B 细胞、CD4⁺ T 细胞和 CD8⁺ T 淋巴细胞。
2. 将 100 µL 抗体混合液加入细胞悬液中。
3. 冰上孵育 25 分钟。
4. 加入 5 mL PBS，于 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。
5. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 含 10% FBS 和 2.5 µg DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 的新鲜 RPMI-1640 培养基中。
6. 利用上述标志物的荧光信号，通过流式细胞术分别收集各亚群淋巴细胞；同时根据 DAPI 信号排除死细胞。

2. 三维定量相位成像

1. 在整个成像过程中将分选后的淋巴细胞置于冰上，并在淋巴细胞从小鼠分离后5小时内完成所有操作，以避免细胞损伤和生化改变。
2. 选择一种已分选的细胞类型（包括B细胞、CD4⁺ T 和 CD8⁺ T 淋巴细胞），并用 RPMI 培养基将样品稀释至 180 个细胞/µL，以获得最佳成像条件（即， 单个视野中一个细胞
3. 将120 μL稀释后的样品通过缓慢注射加入成像室。用显微镜仔细检查成像室中是否存在气泡。若发现气泡，需小心去除，因为气泡会影响测量结果的质量。
4. 使用商用三维定量相位显微镜（或称全息层析成像）及其成像软件获取三维折射率断层图像。
   注意有关实验装置的详细信息可参见原始论文。
   1. 在显微镜物镜上滴加一滴蒸馏水。
   2. 将装有样品的成像室置于显微镜的移动载物台上，调整其位置，使样品与物镜对齐。
   3. 在成像软件的“显微镜”界面中，点击“校准”选项卡下的“聚焦”和“表面”按钮，分别调整物镜和聚光镜的轴向位置。
   4. 单击“自动模式”以校准物镜和聚光镜。或者，使用扫描模式并手动调节镜头，使照明图案位于视场中央区域。
   5. 返回正常模式，调节移动载物台以在视野中定位一个细胞。
   6. 通过调节物镜的轴向位置找到焦平面。完美对焦会使屏幕上显示的样品边界几乎不可见。
   7. 调整载物台，找到一个无细胞的位置。
   8. 单击“校准”以在不同照明角度下测量多个二维全息图。
   9. 调节载物台，将细胞移至视野中央。
   10. 转到“Acquisition”选项卡，点击3D Snapshot，以与步骤2.4.8中相同的照明角度测量细胞的全息图。
   11. 当获取的数据显示在“数据管理”面板上时，右键单击该数据，然后点击“处理”，以利用成像软件中实现的衍射层析成像算法，从步骤 2.4.8 和 2.4.10 中测得的全息图重建三维折射率（RI）断层图像。
   12. 重复步骤 2.4.5–2.4.11，以测量超过 100 个细胞，确保机器学习的统计效力。
   13. 所有经过步骤 2.4.11 处理的图像均可进行可视化。在“数据管理”面板中，右键单击数据并点击“打开”以可视化数据。在“数据管理器”面板中点击“RI 断层图像”。在“预设”选项卡中，点击“加载”，然后双击“lymphocyte.xml”文件，该文件是由成像软件提供的预定义传递函数，用于根据三维折射率（RI）分布可视化断层图像。
5. 重复步骤 2.2–2.4，以测量所有淋巴细胞亚型的三维折射率断层图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
流式细胞术	BD Biosciences	Aria II 或 III
成像培养皿	Tomocube, Inc.	TomoDish
全息层析成像	Tomocube, Inc	HT-1H
全息层析成像软件	Tomocube, Inc.	TomoStudio
图像处理软件	MathWorks	Matlab R2017b
锥形离心管（Falcon）	ThermoFisher Scientific	14-959-53A	15 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	806544-500ML
氯化铵-氯化钾裂解缓冲液	ThermoFisher Scientific	A1049201
RPMI-1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	10438018