一种利用磁性玻璃微粒介导的血液核酸提取技术

摘要

来源：Rosenstierne, M. W.，等。全血样本中病毒检测的快速、安全、简便的手动床旁核酸提取方法。视觉化实验杂志（2018）。

本视频演示了一种利用磁性玻璃颗粒（MGPs）从全人血中提取核酸的技术——MGPs是表面包被二氧化硅的小型磁珠。通过裂解缓冲液裂解血细胞后，释放出的核酸会结合到包被二氧化硅的MGPs表面，从而从样本中分离出核酸分子。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行

1. 患者血液采集

注意：从患者采集全血时，应采取适当的实验室安全措施。佩戴手套和护目镜。如果患者处于隔离状态，请遵循生物安全四级（BSL-4）操作规程。

1. 采集患者静脉全血时，使用带有细径延长管的蝶形针，并连接含有裂解/结合缓冲液的真空采血管。将患者手臂置于向下位置，并使采血管位于蝶形针下方。将蝶形针插入患者静脉后，将真空采血管连接至细径延长管。
   注意：此操作可防止反流。
2. 采血完成后，通过翻转采血管5–10次以混匀管内内容物。
   注意：由于含有1.6 mL裂解/结合缓冲液的采血管内仍保持真空状态，所采集的样本体积将自动精确为1.6 mL。
3. 使用70%乙醇对外部管壁进行消毒。
4. 将采血管在室温下孵育20分钟。
   注意：本步骤可作为暂停点，全血采血管可在-20 °C、5 °C、25 °C或37 °C下保存至少1个月。
5. 随后直接进入简化的核酸提取步骤。

2. 全血核酸提取的简化方法

1. 为从裂解/结合缓冲液灭活的采集血液中纯化核酸（NA），用手翻转真空采血管5至10次，混匀管内内容物。
2. 小心取下管盖，并弃去管盖。
3. 将预先准备好的磁性玻璃粉（MGPs）分装液（1 mL）直接倒入血液采集管中。
4. 使用一支未使用的血液采集管的新管盖盖住含有样本的管子。
5. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭，用手翻转血液采集管5至10次，混匀管内内容物。
6. 将管子放入磁力架中，并用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
7. 用手翻转带有管子的磁力架数次，确保所有磁性玻璃粉（MGPs）均被吸附至磁铁一侧的管壁上。
   注意：磁力架可用一根细长磁铁和一根橡胶圈替代。
8. 打开管盖，使用一次性移液器或直接倾倒的方式将管内液体转移至50 mL收集管中并弃去。
   注意：为避免50 mL收集管产生气溶胶，请及时盖上管盖。
9. 将预先准备好的洗涤缓冲液-1（WB-1，4 mL）分装液直接倒入血液采集管中。
10. 盖上管盖，并用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
11. 在确保管盖被手指牢固压紧的情况下，将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡胶圈，则直接取下橡胶圈和磁铁即可。
12. 用手翻转血液采集管5至10次，重悬磁性玻璃粉（MGPs）。
13. 重复步骤2.6至2.8。
14. 将预先准备好的WB-2缓冲液（1.5 mL）分装液直接倒入血液采集管中。
15. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡胶圈，则直接取下橡胶圈和磁铁即可。
16. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
17. 用手翻转血液采集管数秒钟，重悬磁性玻璃粉（MGPs）。
18. 重复步骤2.6至2.8。
19. 将预先准备好的WB-3缓冲液（3 mL）分装液直接倒入血液采集管中。
20. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡胶圈，则直接取下橡胶圈和磁铁即可。
21. 用手指按住管盖以确保管子紧密封闭。
22. 用手翻转血液采集管5至10次，重悬磁性玻璃粉（MGPs）。
23. 重复步骤2.6至2.8。
24. 将预先准备好的洗脱缓冲液（EB，100 µL）分装液直接倒入血液采集管中。
25. 盖上管盖，并将管子从磁力架上取下。
    注意：若使用磁铁和橡胶圈，则直接取下橡胶圈和磁铁即可。
26. 用手指轻弹血液采集管5至10次，使磁性玻璃粉（MGPs）在洗脱缓冲液（EB）中充分重悬。
    注意：本步骤可暂停，将管子储存于-20 °C条件下。
27. 使用1.5 mL一次性移液器，取一滴重悬后的磁性玻璃粉（MGPs）（5–8 µL），转移至下游核酸扩增反应体系中（可使用任何下游核酸扩增检测方法，如环介导等温扩增（LAMP）、逆转录LAMP（RT-LAMP）或定量聚合酶链式反应（qPCR）/逆转录qPCR（RT-qPCR）等）。
    注意：核酸（NAs）会吸附在磁性玻璃粉（MGPs）上，因此务必在下游核酸扩增反应中使用MGPs。使用前需混匀MGPs悬浮液。混匀后，MGPs将沉降至管底。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vacutainer K2 EDTA 试管 (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus 血液采集管	Becton Dickinson	362725
23G x 1 针头	Becton Dickinson	300800
LUER LOK 注射器 (3 mL)	Becton Dickinson	309658
带细径延长管的蝶形针	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA 分离试剂盒 I - 裂解/结合缓冲液 - 补充装	Roche Diagnostics A/S	3246752001
MagNA Pure LC 总核酸分离试剂盒	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管 (1.8 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管 (3.6 mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ 生物样本库和细胞培养冻存管 (4.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12303D
移液吸头 (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ 细口移液吸头 (1.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific	339652