在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

摘要

来源：Zheng, P., 等. 在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种在支撑脂质双层（SLB）上可视化自然杀伤（NK）细胞免疫突触形成的实验技术。首先，将荧光标记的NK细胞活化受体配体与SLB结合，随后加入NK细胞进行孵育。接着，对细胞进行聚合肌动蛋白和含穿孔素的杀伤颗粒染色。该方法可利用受激发射损耗（STED）显微镜实现对突触形成过程的可视化观察。

方案

1. 脂质体的制备

1. 计算所需氯仿悬浮储存液的量，包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-帽状生物素（Biotin-PE），以配制所需终浓度的稀释储存液。若要分别配制10 ml、终浓度为400 μM DOPC 和 80 μM Biotin-PE 的磷脂溶液，可先将629 μl 的10 mg/ml DOPC 溶液和88 μl 的10 mg/ml Biotin-PE 溶液分别加入不同的玻璃色谱管中。
   注意：在转移DOPC和Biotin-PE的氯仿悬浮储存液时，务必使用清洗液（1 L 95%乙醇与含60 g氢氧化钾（KOH）的120 ml水混合）清洗玻璃Hamilton注射器和玻璃色谱管。
2. 在化学通风橱中用氩气流吹干氯仿。用Parafilm封住色谱管口。
3. 将新干燥的脂质体置于冻干机中，在高真空条件下过夜（O/N）以去除任何残留的氯仿；若需当日完成，可干燥60–90分钟。
4. 在冻干过程中，准备适量稀释缓冲液。本实验方案中，配制25 ml缓冲液，含25 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl 和2%（质量比）正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）去垢剂。先将前两种组分混合，然后在加入干燥的OG粉末前用氩气置换氧气。配制完成后，用0.2微米醋酸纤维素膜过滤OG溶液，并于4°C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18:1 (Δ9-顺式) PC (DOPC) 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱	Avanti	850375C	脂质体准备
18:1 生物素帽PE 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-(帽生物素)(钠盐)	Avanti	870273C	脂质体准备
压缩氩气	Airgas	UN1006	脂质体准备
冷冻干燥机	Labconco	Freezone 7740020	脂质体准备
冷冻干燥管	Labconco	7540200	脂质体准备
层析柱	Santa Cruz	sc-205558	脂质体准备
1 M Tris pH 8.0	Ambion	AM9856	脂质体准备
5 M NaCl	Ambion	AM9759	脂质体准备
辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	O1008	脂质体准备
透析管	Spectrum Labs	132676	脂质体准备
96孔V型底聚苯乙烯板（未处理）	Corning	3896	抗体密度测定
非功能化二氧化硅微珠	Bangs Laboratories	SS06N	抗体密度测定
FACS管	Fisher Scientific	14-959-2A	抗体密度测定
QuantumTM MESF微珠	Bangs Laboratories	可变	抗体密度测定
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C0875	脂质双层制备
HEPES缓冲盐水 + 1% HSA	自制		脂质双层制备
链霉亲和素	Life technologies	434301	脂质双层制备
荧光标记的生物素化蛋白	自制		脂质双层制备
ibidi Sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608	脂质双层制备
25x75 mm 玻璃盖玻片	ibidi	10812	脂质双层制备
过氧化氢（30%）	Fisher Scientic	BP2633	脂质双层制备
硫酸	Sigma-Aldrich	258105	脂质双层制备
D-生物素	Invitrogen	B20656	脂质双层制备
镜头纸	VWR	54826-001	用于成像
F型浸油	Leica	11 513 859	用于成像
Leica TCS STED显微镜	Leica		用于成像