在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

摘要

来源：Zheng, P., 等. 在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种在支撑脂质双层（SLB）上可视化自然杀伤（NK）细胞免疫突触形成的实验技术。首先，将荧光标记的NK细胞活化受体配体与SLB结合，随后加入NK细胞进行孵育。接着，对细胞进行聚合肌动蛋白和含穿孔素的杀伤颗粒染色。该方法可利用受激发射损耗（STED）显微镜实现对突触形成过程的可视化观察。

方案

1. 脂质体的制备

1. 计算所需氯仿悬浮储存液的量，包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-帽状生物素（Biotin-PE），以配制所需终浓度的稀释储存液。若要分别配制10 ml、终浓度为400 μM DOPC 和 80 μM Biotin-PE 的磷脂溶液，可先将629 μl 的10 mg/ml DOPC 溶液和88 μl 的10 mg/ml Biotin-PE 溶液分别加入不同的玻璃色谱管中。
   注意：在转移DOPC和Biotin-PE的氯仿悬浮储存液时，务必使用清洗液（1 L 95%乙醇与含60 g氢氧化钾（KOH）的120 ml水混合）清洗玻璃Hamilton注射器和玻璃色谱管。
2. 在化学通风橱中用氩气流吹干氯仿。用Parafilm封住色谱管口。
3. 将新干燥的脂质体置于冻干机中，在高真空条件下过夜（O/N）以去除任何残留的氯仿；若需当日完成，可干燥60–90分钟。
4. 在冻干过程中，准备适量稀释缓冲液。本实验方案中，配制25 ml缓冲液，含25 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl 和2%（质量比）正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）去垢剂。先将前两种组分混合，然后在加入干燥的OG粉末前用氩气置换氧气。配制完成后，用0.2微米醋酸纤维素膜过滤OG溶液，并于4°C保存。
5. 此外，另准备两个1 L的螺口瓶，装入相同浓度但不含OG的Tris-盐水缓冲液。每个瓶底放入一个经蒸馏水清洗的磁力搅拌子。再额外准备6 L Tris-盐水缓冲液。用氩气去除所有瓶中的氧气，并同样置于4°C保存。
6. 冻干完成后，将干燥的脂质溶解于Tris-盐水OG缓冲液中，分别配制成4 mM的溶液。根据上述体积示例，向DOPC管中加入2 ml缓冲液，向Biotin-PE管中加入0.2 ml缓冲液。
7. 将Biotin-PE脂质与DOPC脂质混合。此步骤可提高支撑脂质双层（SLB）的流动性，因为结合的生物素可能影响磷酸头部基团的流动性。为获得80 μM Biotin-PE的终浓度，取0.2 ml 4 mM Biotin-PE溶液与1 ml 4 mM DOPC溶液混合，然后加入8.8 ml Tris-盐水OG缓冲液。
8. 为获得400 μM DOPC的终浓度，仅需将1 ml 4 mM DOPC溶液与9 ml Tris-盐水OG缓冲液混合即可。
9. 将超声仪水浴中加入冰水。使用通用夹具将装有稀释磷脂的玻璃管置于超声仪中心位置。超声处理稀释后的磷脂溶液10分钟，直至溶液变澄清。
   注意：向超声水浴中添加冰块以维持低温，因为超声过程会产生热量。
10. 用氩气填充管内空间，以置换液体上方空气中的氧气，并用Parafilm密封管口。

2. 脂质体的透析

1. 从卷装中截取两段适当长度（本示例中为40 cm）的干燥透析管（分子量截留值：12-14,000，直径：6.4 mm），每种磷脂稀释液各用一段。
2. 将管段放入玻璃烧杯中，加入200 ml蒸馏水浸泡2分钟以使其重新水化。
3. 高火微波加热5分钟，或至少加热至水沸腾。
4. 在每根管子的一端打结，并用几毫升 Tris-盐水-OG 缓冲液冲洗管内。随后仔细挤出尽可能多的洗涤缓冲液，以尽量减少管内残留的缓冲液量。
5. 在超净工作台中，将稀释后的磷脂加入各管中，并用小型透析管夹夹住管口两端，以完全排除空气。为彻底排除空气，需在“水线”以下夹闭，从而牺牲少量样品体积。
6. 将样本浸入先前准备好的不含OG的Tris-盐水缓冲液瓶中。在重新密封前，用氩气置换瓶中的氧气，并于4°C下搅拌过夜。
7. 每12小时将导管转移至一瓶新的不含OG的Tris-盐水缓冲液中，至少重复3次。
8. 在移除透析后的脂质之前不久，准备若干小离心管用于分装脂质，每管先充入氩气以置换其中的氧气。
9. 36 h后，将透析瓶放入超净工作台，从瓶中取出透析管。准备一张吸水纸或烧杯以收集透析管表面的液体。
10. 剪断夹子上方的透析管，然后取下夹子，小心转移透析后的脂质溶液 通过 将溶液分装至预置于冰上、充有氩气的预处理试管中，每管1 ml。
11. 分装水相脂质体溶液，并用氩气流再次置换每支试管中的氧气。
12. 将脂质体在 4°C 下保存。切勿冷冻。

3. 分离与培养人自然杀伤细胞

1. 将15 ml外周血或血沉棕黄层分装至50 ml锥形管中。用含1%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释血液。
2. 用10 ml血清移液管将13 ml Ficoll溶液轻柔地加入管底。
3. 以1,200 × g离心20分钟，加速度和减速度设置为开启状态或调至最低档。
4. 离心后，用血清移液管收集漂浮的乳白色中间层——即外周血单个核细胞（PBMCs），该层位于上层透明黄色液体与下层较浑浊的浅色液体之间的界面处，而这两层均位于最底层红细胞（RBCs）之上。注意：收集PBMCs时不得混入任何红细胞。
5. 将收集的PBMCs转移至新的50 ml锥形管中，用含1% FBS的PBS定容并混匀。再次离心，此次将加速度和减速度调至最大，以300 × g离心5分钟。
6. 弃去上清液，将细胞重悬于10 ml含1% FBS的PBS中。
7. 在与步骤3.6相同条件下再次离心的同时进行细胞计数。
8. 再次弃去上清液，将细胞以1000万个细胞/ml的密度重悬于R10培养基中。
9. 取3000万个细胞置于5 ml聚苯乙烯管中，按照生产商说明书使用磁性分离试剂盒分离自然杀伤（NK）细胞。分离完成后，再次计数细胞，并以50万个细胞/ml的密度重悬于含IL-2（100 U/ml）的完全R10培养基中（88% Roswell Park Memorial Institute培养基，RPMI；10% FBS；1% N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，HEPES；1%丙酮酸钠）。在37°C、含CO₂的培养箱中培养，每周更换培养基2–3次。

4. 组装玻璃支撑的平面脂质双层

1. 在烧杯中按1:3的比例混合30%过氧化氢与硫酸，制备100 ml的piranha溶液。
   注意：操作硫酸等有毒试剂时，必须在指定的化学通风橱内进行。
2. 将两片矩形的#1.5盖玻片浸入该piranha溶液中，处理20-30分钟。
   注意：使用piranha溶液清洗盖玻片至关重要。
3. 在盖玻片清洗的同时，取一支预先配制的400 μM DOPC脂质管和一支预先配制的80 μM Biotin-PE脂质管，置于冰上并转移至氩气钢瓶处。
4. 用氩气置换一支新的微量离心管中的氧气，然后按1:1比例加入DOPC和Biotin-PE脂质。具体体积根据实验需求而定，但每种至少应加入2 μl。在混合管中再次用氩气置换氧气，同时对各试剂管也进行同样操作，之后将试剂管放回冰箱。
5. 清洗完成后，用去离子水彻底冲洗盖玻片，并将其置于空气中晾干数分钟。
6. 吸取第5.4步制备的脂质体混合液1.5 μl，以单滴形式加入载玻片的一个通道腔室中。每个通道使用两滴是常规做法，但并非必需。
7. 迅速而高效地将干燥的盖玻片覆盖在液滴上。确保液滴之间保持足够间距，避免盖玻片放置后液滴融合。此外，确保液滴保持圆形且轮廓清晰，不接触腔室壁边缘。在各通道之间及周围用力按压，以确保盖玻片与载玻片之间形成密封。
8. 使用记号笔标记液滴的位置。
9. 向腔室中通入100 μl含5%酪蛋白的水溶液，用于封闭双分子层。尽量确保流动腔室内无气泡产生。
10. 向每个通道注入100 μl浓度为333 ng/ml的链霉亲和素，室温（RT）孵育10-15分钟。随后，每个通道通入3 ml HEPES缓冲盐水（HBS）/1%人血清白蛋白（HSA）以洗去未结合的链霉亲和素。
11. 加入100 μl生物素化荧光标记的抗CD16抗体（如Alexa Fluor 568），其蛋白浓度应为先前确定的最佳有效浓度。避光孵育20-30分钟。再次每个通道通入3 ml HBS/1% HSA进行清洗。
12. 向腔室中通入100 μl浓度为25 nM的D-生物素，以结合任何残留的链霉亲和素，从而消除链霉亲和素与细胞发生非特异性结合的可能性。
13. 计数NK细胞，并以HBS/1% HSA重悬至浓度为500,000/ml。
14. 在细胞离心过程中，每个通道用额外的3 ml HBS/1% HSA清洗腔室，以去除D-生物素。
15. 在加入NK细胞前，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）或共聚焦显微镜进行光漂白后荧光恢复（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）实验，检测SLB上配体的流动性。
16. 细胞离心完成后，按所需浓度重悬，向每个通道加入100 μl细胞悬液。
17. 将腔室置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育30-60分钟。
18. 孵育结束后，室温下用4%多聚甲醛固定细胞10-20分钟。每个通道通入3 ml PBS清洗以去除多聚甲醛。
19. 加入400 μl封闭缓冲液（含5%正常驴血清和0.2% Triton X-100的PBS）。室温孵育30分钟。
20. 通过加入200 μl稀释的荧光标记鬼笔环肽（1单位/ml标记鬼笔环肽）和荧光标记抗穿孔素单克隆抗体（500 ng/ml抗穿孔素mAb）对F-肌动蛋白和穿孔素进行染色。室温避光孵育1小时。
21. 每个通道通入3 ml PBS清洗。腔室即可用于成像。

使用 STED 在脂质双层膜上对 NK 突触进行成像

1. 开启所有必要的硬件模块。
2. 启动图像分析软件，启用共振扫描和STED模块。完成这些选择后，等待约3-5分钟，使软件完成初始化。
3. 点击屏幕顶部的“Configuration”选项卡。
4. 选择“Laser Config”，然后打开白光激光器和STED 592 nm激光器。
5. 选择100x物镜，并对齐激发激光束与592 nm耗尽激光束。
6. 返回“Laser Config”模块，关闭592 nm耗尽激光器，打开660 nm耗尽激光器。
7. 将载玻片放置在载物台上，位于物镜上方。使用白光灯和目镜，将结合在划定双层区域上的细胞调至焦点。
8. 返回“Configuration”选项卡右侧紧邻的“Acquisition”选项卡。
9. 点击“Switch to Whitelight”选项卡，然后开启该模块，并将激发激光线拖动至合适的波长位置。
10. 从可用列表中选择所需的探测器，然后设置检测范围以覆盖相应的波长范围。
    注意：切勿将检测范围直接设置在激发光束下方。
11. 点击左侧“Acquire”工具栏中的“Seqential”按钮，以在左侧工具栏底部弹出顺序扫描对话框。此功能允许用户添加多个序列，每个序列使用不同颜色的激发光束。选择“Between Frames”，然后为每种额外颜色按照步骤5.9和5.10设置激发频率、探测器及检测范围。
12. 所有参数优化完成后，点击“Start”以开始采集过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18:1 (Δ9-顺式) PC (DOPC) 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱	Avanti	850375C	脂质体准备
18:1 生物素帽PE 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-(帽生物素)(钠盐)	Avanti	870273C	脂质体准备
压缩氩气	Airgas	UN1006	脂质体准备
冷冻干燥机	Labconco	Freezone 7740020	脂质体准备
冷冻干燥管	Labconco	7540200	脂质体准备
层析柱	Santa Cruz	sc-205558	脂质体准备
1 M Tris pH 8.0	Ambion	AM9856	脂质体准备
5 M NaCl	Ambion	AM9759	脂质体准备
辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	O1008	脂质体准备
透析管	Spectrum Labs	132676	脂质体准备
96孔V型底聚苯乙烯板（未处理）	Corning	3896	抗体密度测定
非功能化二氧化硅微珠	Bangs Laboratories	SS06N	抗体密度测定
FACS管	Fisher Scientific	14-959-2A	抗体密度测定
QuantumTM MESF微珠	Bangs Laboratories	可变	抗体密度测定
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C0875	脂质双层制备
HEPES缓冲盐水 + 1% HSA	自制		脂质双层制备
链霉亲和素	Life technologies	434301	脂质双层制备
荧光标记的生物素化蛋白	自制		脂质双层制备
ibidi Sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608	脂质双层制备
25x75 mm 玻璃盖玻片	ibidi	10812	脂质双层制备
过氧化氢（30%）	Fisher Scientic	BP2633	脂质双层制备
硫酸	Sigma-Aldrich	258105	脂质双层制备
D-生物素	Invitrogen	B20656	脂质双层制备
镜头纸	VWR	54826-001	用于成像
F型浸油	Leica	11 513 859	用于成像
Leica TCS STED显微镜	Leica		用于成像