自然杀伤细胞介导的细胞毒作用检测样本制备用于流式细胞术分析

摘要

来源：McBride, J. E., 等. 利用流式细胞术分析人全血中自然杀伤细胞的杀伤活性. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了自然杀伤细胞对荧光标记靶细胞的裂解活性。该方法通过染色死亡细胞，并利用流式细胞仪定量活细胞和死细胞，从而实现自然杀伤细胞介导的细胞毒性的检测。

方案

1. 对照组的制备

1. 将以下成分分别转移至已做好相应标记的 1.5 ml 离心管中：
   1. 向标记为“双阳性”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
   2. 向标记为“仅 DiO”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
   3. 向标记为“仅碘化丙啶 (PI)”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬未标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
2. 将双阳性管和仅含 PI 的管置于 55 °C 水浴中孵育 5 分钟。
3. 5 分钟后，取出离心管并用 70% 乙醇擦拭管壁。
4. 向双阳性管和仅含 PI 的 1.5 mL 管中各加入 10 µL PI。
5. 将全部三个 K562 靶细胞对照管放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
6. 30 分钟孵育结束后，以 163 × g 离心 2 分钟，沉淀全部三个 K562 靶细胞对照样本。
7. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
8. 每管对照样本用 20 µL 新鲜 IMDM 细胞培养基重悬，并置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中至少孵育 30 分钟，以获得最佳....

结果

图1：细胞毒性活性分析的代表性直方图、散点图和图像。（A）聚焦细胞分析。（B）单细胞分析。（C）靶细胞染色分析。所有判断均基于每个事件所附图像作出，可通过在分析软件的图表上直接点击相应事件来查看。（D）双联体事件的代表性图像，显示一个凋亡的NK细胞和一个活的K562靶细胞。Ch01，明场。Ch02，DiO。Ch05，PI。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K-562 淋巴母细胞	ATCC	CCL-243
Iscove 改良的 Dulbecco 培养基	ATCC	30-2005	高葡萄糖，含 L-谷氨酰胺，含 HEPES，经无菌过滤
α 最低必需培养基	ATCC	CRL-2407	不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，含 2 mM L-谷氨酰胺和 1.5 g/L 碳酸氢钠
碘化丙啶染色液	BD Pharmingen	51-66211E
Vybrant DiO 细胞标记溶液	Vybrant	V-22886
ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪
全血 CD56 微珠，人源	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
INSPIRE 软件	EMD Millipore	Mark II 版本，2013 年 9 月
Ideas 应用软件	EMD Millipore		6.1 版本，2014 年 7 月