自然杀伤细胞介导的细胞毒作用检测样本制备用于流式细胞术分析

摘要

来源：McBride, J. E., 等. 利用流式细胞术分析人全血中自然杀伤细胞的杀伤活性. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了自然杀伤细胞对荧光标记靶细胞的裂解活性。该方法通过染色死亡细胞，并利用流式细胞仪定量活细胞和死细胞，从而实现自然杀伤细胞介导的细胞毒性的检测。

方案

1. 对照组的制备

1. 将以下成分分别转移至已做好相应标记的 1.5 ml 离心管中：
   1. 向标记为“双阳性”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
   2. 向标记为“仅 DiO”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬 DiO 标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
   3. 向标记为“仅碘化丙啶 (PI)”的 1.5 mL 管中加入 500 µL 含重悬未标记 K562 细胞的新鲜 IMDM 培养基。
2. 将双阳性管和仅含 PI 的管置于 55 °C 水浴中孵育 5 分钟。
3. 5 分钟后，取出离心管并用 70% 乙醇擦拭管壁。
4. 向双阳性管和仅含 PI 的 1.5 mL 管中各加入 10 µL PI。
5. 将全部三个 K562 靶细胞对照管放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
6. 30 分钟孵育结束后，以 163 × g 离心 2 分钟，沉淀全部三个 K562 靶细胞对照样本。
7. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
8. 每管对照样本用 20 µL 新鲜 IMDM 细胞培养基重悬，并置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中至少孵育 30 分钟，以获得最佳 DiO 荧光信号。
   注意：对照样本现可进行成像流式细胞术检测。

2. 细胞毒性检测样品制备

1. 根据每个样本/参与者的情况，准备并标记1.5 mL离心管。
2. 在每根离心管中加入所需比例的NK细胞和DiO标记的K562细胞。
   注：例如，K562靶细胞与NK效应细胞的期望比例为1:5。
3. 以135 × g离心5分钟。
4. 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
5. 用500 µL不含白细胞介素-2（IL-2）和2-巯基乙醇（2-ME）的NK细胞培养基（不完全NK细胞培养基）重悬NK细胞与DiO标记的K562细胞的混合物。
   注：不完全NK细胞培养基为含碳酸氢钠的Eagle最低必需培养基，不含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷。
6. 向每根离心管中加入5 µL碘化丙啶（PI）。
7. 以163 × g离心2分钟。
8. 将细胞在37 °C孵育2小时。
9. 孵育2小时后，以163 × g离心2分钟。
10. 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
11. 用25 µL不完全NK细胞培养基重悬细胞。

3. 自发性（“S”）样品的制备

1. 用移液器将500 µl DiO标记的K562细胞（浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL）加入1.5 mL离心管中。
2. 向每根离心管中加入10 µL PI。
3. 以163 × g离心2分钟。
4. 将细胞在37 °C下孵育2小时。
5. 孵育2小时后，以163 × g离心2分钟。
6. 小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。
7. 将细胞重悬于25 µl 不完全α-最低必需培养基（α-MEM）培养液中。

使用成像流式细胞仪进行数据采集

1. 按下成像流式细胞仪前门内的绿色按钮，以开启仪器。
2. 打开与成像流式细胞仪相关联的所有计算机。
3. 启动成像流式细胞仪软件。
4. 点击“启动”按钮，以冲洗系统并准备样品管路。
5. “启动”完成后，关闭“校准”窗口。
6. 分配通道：在左上方，依次点击每个通道以进行分配。
7. 在右侧，点击散点图按钮，创建四个散点图：Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06、Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02、Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 以及 FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01。
8. 首先使用“双阳性”对照开始分析样品。
   1. 点击“加载”。
   2. 将步骤 1.4 至 1.8 中制备的含有“双阳性”样品的 1.5 ml 管放入样品加载器中。
   3. 在“放大倍数”选项卡下选择 40X 物镜。
   4. 打开 405 mW 和 642 mW 激光器。
   5. 打开“明场”通道。
   6. 点击“选择强度”。
   7. 根据“双阳性”对照样品，确定 405 mW 激光器所需强度，以避免探测器过载。
      注意：例如，本实验的最佳强度设置为 11 mW。
9. 完成所需设置后，开始采集数据。
   1. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本，并选择用于保存数据文件的文件夹。
   2. 在“采集”旁边输入需采集的细胞数量。通常该数值在 1,000 至 10,000 之间。
   3. 点击“采集”。
      注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
10. 采集完成后，加载下一个对照样品——仅 DiO 对照。
    1. 点击“加载”。
    2. 将含有“仅 DiO”样品的 1.5 mL 管放入样品加载器中。
    3. 保持“放大倍数”选项卡下的 40X 物镜处于选中状态。
    4. 保持 405 mW 激光器开启。
    5. 关闭 642 mW 激光器和“明场”通道。
       注意：现已完成所需设置，可开始采集数据。
    6. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本，并选择用于保存数据文件的文件夹。在“采集”旁边输入需采集的细胞数量。通常该数值为 1,000。
    7. 点击“采集”。
       注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
11. 对“仅 PI”对照样品重复步骤 4.10。现在可开始采集实验样品。
12. 按以下方式处理其余实验样品，包括“自发‘S’样品”：
    1. 保持“放大倍数”选项卡下的 40X 物镜处于选中状态。
    2. 打开 405 mW 和 642 mW 激光器。
    3. 打开“明场”通道。
    4. 点击“设置强度”。
    5. 在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名文本，并选择用于保存数据文件的文件夹。输入自定义文件名文本。
    6. 在“采集”旁边输入需采集的细胞数量。
    7. 点击“采集”按钮。
       注意：当达到所需细胞数量后，数据文件将自动保存至先前选定的文件夹中。
13. 对所有实验样品重复步骤 4.12。
14. 在所有实验数据和文件采集完成后，点击“关机”按钮以对系统进行灭菌处理。

5. 成像流式细胞仪样本分析

1. 打开成像流式细胞仪分析软件应用程序。
2. 在“文件”下，打开一个 experimental.RIF 文件。
3. 在成像流式细胞仪软件的补偿选项卡中，选择“创建新矩阵”，使用单色.RIF 文件（DiO 单独对照和 PI 单独对照，于步骤 4.10 和 4.11 中创建）构建一个新的矩阵。
   注意：软件将提示选择单色文件，并将其合并以生成一个矩阵文件（.ctm 文件扩展名），该文件需被选中以应用通道补偿。
4. 使用软件的“构建模块”功能创建散点图。
   1. 创建一个散点图（BrightFieldGradient_RMS 对 频率），用于圈选聚焦良好的细胞。将此门命名为“Focus”（图 1A）。
   2. 基于“Focus”门，创建一个明场面积（Bright Field Area）对明场长宽比（Bright Field Aspect Ratio）的散点图，用于圈选单细胞群体。将此门命名为“Single”（图 1B）。
   3. 基于“Single”门，创建一个 Intensity_MC_Ch02 对 Intensity_MC_Ch5 的散点图。利用该图识别并圈选仅 DiO 阳性的细胞（靶细胞，存活）以及 PI 与 DiO 双阳性的细胞（靶细胞，死亡）（图 1C）。
      注意： 步骤 5.4.1、5.4.2 和 5.4.3 中描述的所有图均可通过软件的“构建模块”功能创建。
5. 点击散点图的统计功能，以获取每个门内的细胞数量。
6. 使用以下公式计算自发释放样本和实验样本中死亡靶细胞的百分比：
   样本中死亡靶细胞百分比 = （死亡靶细胞数 × 100）/（存活靶细胞数 + 死亡靶细胞数）
7. 使用以下公式计算细胞毒性：
   细胞毒性百分比 = [（实验组死亡率 - 自发释放组死亡率）/（100 - 自发释放组死亡率）] × 100

结果

图1：细胞毒性活性分析的代表性直方图、散点图和图像。（A）聚焦细胞分析。（B）单细胞分析。（C）靶细胞染色分析。所有判断均基于每个事件所附图像作出，可通过在分析软件的图表上直接点击相应事件来查看。（D）双联体事件的代表性图像，显示一个凋亡的NK细胞和一个活的K562靶细胞。Ch01，明场。Ch02，DiO。Ch05，PI。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K-562 淋巴母细胞	ATCC	CCL-243
Iscove 改良的 Dulbecco 培养基	ATCC	30-2005	高葡萄糖，含 L-谷氨酰胺，含 HEPES，经无菌过滤
α 最低必需培养基	ATCC	CRL-2407	不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，含 2 mM L-谷氨酰胺和 1.5 g/L 碳酸氢钠
碘化丙啶染色液	BD Pharmingen	51-66211E
Vybrant DiO 细胞标记溶液	Vybrant	V-22886
ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪
全血 CD56 微珠，人源	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II 成像流式细胞仪	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
INSPIRE 软件	EMD Millipore	Mark II 版本，2013 年 9 月
Ideas 应用软件	EMD Millipore		6.1 版本，2014 年 7 月