基于琼脂糖的人类精密切割肺组织片制备

摘要

来源：Neuhaus, V. 等., 利用人源精密切割肺组织片评估物质的细胞毒性和免疫调节作用. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们描述了一种使用琼脂糖灌注离体人肺并制备人源精密切割肺片的方法。所制备的 离体 肺组织切片可用于进一步的免疫学实验。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 人肺组织切片的常规制备及后续化学物质暴露

注意：填充肺脏需要两人协作完成。建议操作人员具备最新的甲型和乙型肝炎疫苗接种记录。患者在肺移植前通常会常规筛查丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）。若诊断或怀疑存在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的活动性感染，则应弃用该肺脏。然而，所有新鲜的人肺组织及其衍生样本均应视为具有潜在传染性，并须采取相应的防护措施（如颗粒物过滤口罩（FFP2）、防护眼镜、手套），以确保工作人员的职业安全。该操作过程耗时60至90分钟。

1. 确认人肺叶的完整性。
   注意：胸膜若有撕裂，会导致组织充填不均。本实验所用的人肺组织须为手术切除当日获取。在用冰上的琼脂糖进行充填前，组织可在室温（RT）下保存约2小时，此期间可耐受。本方案中使用的组织来源于接受肺叶切除术的患者，而非来自已故捐献者。若组织曾置于冰上保存，充填前需先恢复至室温，否则琼脂糖会立即聚合，无法实现均匀充填。
   注意：所有接触未经处理人源组织的人员必须穿戴防护服，包括实验服、两副手套、帽子、口罩和护目镜。人源组织可能具有潜在感染性。
2. 称取7.5 g低熔点琼脂糖，加入250 mL双蒸水中。将琼脂糖溶液放入微波炉中加热至沸腾，直至完全溶解。根据琼脂糖的熔点和凝固点，冷却至约40 °C。
   注意：所需烧瓶数量取决于肺叶大小。
3. 将培养基（材料表）预热并维持在37 °C。
   注意：若琼脂糖温度过高，培养基中的维生素将失活，细胞可能受损。若培养基/琼脂糖溶液温度低于37 °C，凝胶过程将提前启动，影响肺组织的均匀充填。仅推荐在37 °C至39 °C范围内操作。
4. 开始操作前，将所有所需材料置于手边：5–10个止血钳、一根长约1 m的柔性导管、与导管连接匹配的合适注射器（例如，50 mL），以及一个装有冰块的冰盒。
5. 将硅胶管插入气管/主支气管进行插管，并用止血钳沿管平行方向夹紧，使止血钳在不压闭管腔的前提下夹紧组织。确认硅胶管已牢固固定于内部，充填过程中不会滑脱。用止血钳封闭其余支气管、血管及损伤部位，防止充填过程中琼脂糖泄漏。
6. 在烧杯中将等体积的3%低熔点琼脂糖与培养基混合。使用50 mL注射器将混合液注入肺组织。每次重新吸取培养基前，需用手指或止血钳夹闭导管，以避免气泡产生和琼脂糖反流。持续充填至肺叶完全膨胀。轻轻触碰肺叶侧面的胸膜，胸膜应均匀且坚硬。
   注意：根据肺叶大小，可能需要多达2–3 L的琼脂糖/培养基混合液。
7. 若单个样本中存在多个支气管，需对每个支气管重复步骤1.5–1.6。
8. 将肺组织置于冰上，使琼脂糖凝胶化，时间约为20–40分钟，具体时长取决于注入的琼脂糖量。从多个方向轻轻触碰胸膜，检查其是否坚硬且冰凉，以判断聚合是否完成；若未完成，需继续等待。交由病理科医生将肺组织切成片状，取样后将组织样本继续置于冰上保存并运输。
9. 使用锋利刀具将人肺组织切成3–5 cm厚的组织块。
   注意：每次处理不同肺组织时应更换新刀片，以确保刀刃锋利。
10. 向组织切片机中加入400 mL冰冻的Earle's平衡盐溶液（EBSS）。立即使用半自动螺丝刀配合所需直径的取芯工具（例如，8 mm；10 mm），从组织块中切取圆柱形组织芯。
    注意：该直径必须与切片机内组织夹具的直径一致。
11. 将肺组织切片厚度调节至所需值。
    注意：在PCLS实验中，通常采用约250 µm的切片厚度。组织切片机制造商推荐使用其Tissue Slice Thickness Gauge验证切片厚度。也可采用整体染色结合共聚焦显微镜的方法测定切片厚度。
12. 将组织芯放入组织切片机的组织夹具中，并将配重（夹具组件）置于组织芯上方。将切片机的臂速和刀速均设置为6，开始切取PCLS。
13. 在500 mL市售Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）：营养混合物F-12 DMEM/F12（1:1）中，加入5 mL青霉素（10,000单位/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）。将培养基在无菌条件下冷藏保存数天。仅预热实验所需体积的培养基。
    注意：青霉素在37 °C下长时间保存会失活。应使用无血清且无染料的培养基，因血清成分批次间存在差异，而染料（如酚红）可能干扰后续检测。
14. 在培养皿（100 × 15 mm）中加入25 mL冰冻培养基。通过打开玻璃圆筒上的止血钳，将切片机中的培养基排入烧杯。使用移液器（例如，接种环）将切片从烧杯转移至含培养基的培养皿中。将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO₂，100%湿度）。在进行洗涤步骤前，让培养基充分升温。
    注意：后续所有操作均需在无菌条件下进行。
15. 将细胞筛置于培养皿中，用于洗涤PCLS。使用10 mL移液管通过细胞筛完全移除培养基，并加入25 mL预热至37 °C的新鲜培养基。每30分钟重复此步骤3–4次。
    注意：细胞筛可防止切片被吸入移液管中，避免切片损伤。
16. 小心将肺切片转移至24孔培养板中，每孔至少加入500 µL培养基，放置两个切片。
    注意：转移时建议使用接种环，让切片自然漂浮至环上，以避免组织损伤。无需进一步分离切片，因仅当新鲜培养基供应不足时才会导致切片内细胞死亡。切片在孔内可相互重叠或接触，此情况对组织活力无影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶管 3.0 x 5.0 mm	A. Hartenstein (Leipzig, Germany)	SS04
注射器	Faust Lab Science (Klettgau, Germany)	9.410 050
取芯工具	定制	Custom-made
修整刀片手柄（FEATHER）	pfm medical ag (Cologne, Germany)	205530001
修整刀片（FEATHER）	pfm medical ag (Cologne, Germany)	205500000
切片机：组织切片器	Alabama R&D (Bad Homburg, Germany)	303400-ADPT	Krumdieck 组织切片器 (MD6000)
切片机刀片	Wilkinson Sword (Solingen, Germany)	ENR-4027800011506
组织培养皿	Sigma (München, Germany)	Z666246-420EA
接种环	Copan Diagnostics (Murrieta, USA)	CD176S01
TPP 24孔组织培养板	Sigma (München, Germany)	Z707791-126EA
包埋盒	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	1000957
Nunc MaxiSorp 平底板	Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)	44-2404-21
Nunc MicroWell 96孔板	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	260836
试剂
低凝胶温度琼脂糖	Sigma (München, Germany)	A9414-100G
平衡盐混合物与溶液，细胞培养，经典培养基与盐类，Earle's 平衡盐溶液（EBSS）	Sigma (München, Germany)	E2888-500ML
青霉素和链霉素	Lonza (Verviers, Belgium)	17-602E
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 Ham 营养混合物（DMEM F-12）	Gibco (Darmstadt, Germany)	11039-047	培养基
含钙镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Lonza (Verviers, Belgium)	BE17-513F