一种用于检测化学诱导人肺组织精准切片细胞毒性的实验方法

摘要

来源：Neuhaus, V. 等，利用人源精密切割肺组织切片评估物质的细胞毒性和免疫调节作用 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种通过WST-1法评估人源性精准切割肺组织切片细胞毒性的技术。将人源性精准切割肺组织切片暴露于梯度浓度的细胞毒性化学物质中，以定量其细胞毒性效应。颜色强度的降低可作为该化学物质对肺细胞产生有害影响的证据。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 人源精密切割肺组织片（PCLS）的常规制备及后续化学物质暴露

注意：填充一个肺需要两个人。建议具备最新的甲型和乙型肝炎疫苗接种记录。在肺移植前，患者通常会进行丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）的常规筛查。如果诊断或怀疑存在 Mycobacterium tuberculosis 的活动性感染，则应弃用该肺。然而，所有新鲜的人肺组织及其衍生样本均必须视为具有潜在传染性，并须采取相应的防护措施（颗粒过滤口罩（FFP2）、护目镜、手套），以确保工作人员的职业安全。该操作耗时60至90分钟。

1. 确认人肺叶的完整性。
   注意： 胸膜撕裂会阻碍组织的均匀灌注。人肺组织必须取自手术切除当天。在冰上用琼脂糖灌注前，室温下保存约2小时是可接受的。本方案所用组织来源于接受肺切除术的患者，而非来自已故捐献者。若组织曾置于冰上保存，灌注前需先升温至室温，否则琼脂糖会立即聚合，无法实现均匀灌注。     
   注意： 确保所有接触人体原代材料的人员穿戴防护服，包括实验服、两副手套、帽子、口罩和一副护目镜。人体材料可能具有感染性。
2. 称取7.5 g低熔点琼脂糖，加入250 mL重蒸水中。在微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。根据琼脂糖的熔点和凝固点，冷却至约40 °C。
   注意： 根据肺叶大小，需要若干个烧瓶。
3. 预热并保持培养基（材料表在 37 °C 下。
   注意： 如果琼脂糖温度过高，培养基中的维生素将失活，细胞也会受到损伤。如果培养基/琼脂糖溶液的温度低于37 °C，凝胶过程将提前启动，影响肺组织的均匀灌注。仅建议使用37 °C至39 °C的温度范围。
4. 开始操作前将所有所需材料置于触手可及之处：5 - 10 个夹子、一根长约 1 m 的柔性导管、一支合适的注射器（例如，50 mL）以连接导管，以及装满冰块的冰盒。
5. 通过插入硅胶管插管气管/主支气管，并用与硅胶管平行方向放置的夹钳固定，使夹钳沿硅胶管周围夹紧组织，但不压迫阻断硅胶管。确认硅胶管已牢固固定于内部，在灌注过程中不会滑脱。使用夹钳封闭所有其他支气管、血管及损伤部位，防止灌注过程中琼脂糖泄漏。
6. 在烧杯中将等体积的3%低熔点琼脂糖与培养基混合。使用50 mL注射器将混合液注入肺组织。每次重新装填培养基前，需用手指或夹子夹闭导管，以避免产生气泡及琼脂糖反流。持续灌注至肺叶完全膨胀。轻轻触碰肺脏一侧的胸膜表面，胸膜应呈现均匀且质地坚实。
   注意： 根据肺叶的大小，可能需要最多2至3升的琼脂糖/培养基溶液。
7. 若单个标本中包含多个支气管，则对每个支气管重复步骤 1.5 - 1.6。
8. 将肺置于冰上，使灌注的琼脂糖凝胶化，时间根据琼脂糖用量而定，为20–40分钟。轻轻触碰胸膜多个部位，检查是否变硬且冰凉，若如此则表明聚合已完成；否则需继续等待。病理学家将把肺切成片状，取样后将肺组织置于冰上保存，以便运输。
9. 用锋利的刀将人肺组织切成3 - 5 cm的片块。    
   注意： 每次处理肺组织时均需使用新刀片，以确保锋利。
10. 将400 mL冰冻的Earle's平衡盐溶液（EBSS）注入组织切片机中。使用半自动螺丝刀配合所需直径的取芯工具，立即从肺组织切片中切取圆柱形组织芯。例如，8 毫米；10 毫米。
    注意： 该直径必须与机器内组织固定装置的直径相等。
11. 调整肺组织切片的厚度至所需值。
    注意： 通常在PCLS实验中使用约250 µm的切片厚度。组织切片仪制造商推荐使用其组织切片厚度测量仪来验证切片厚度。或者，也可采用Brismar所述的全 mount 染色结合共聚焦显微镜的方法来测定切片厚度。 等
12. 将组织芯转移至组织切片机的组织架中。将组织架的配重（组织架的组成部分）置于组织芯上方。将组织切片机的臂速和刀速均设置为6。开始将组织芯切割成PCLS。
13. 将500 mL市售的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）：营养混合物F-12 DMEM/F12（1:1）加入5 mL青霉素（10,000单位/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）。在无菌条件下将培养基置于冰箱中保存数天。仅预热所需体积的培养基。      
    注意： 青霉素在37 °C长时间保存会失活。应使用无血清且无染料的培养基，因为血清成分存在批间差异，而染料（如酚红）可能干扰实验检测。
14. 用25 mL冰冻培养基填充一个培养皿（100 × 15 mm）。通过打开玻璃圆筒上的夹子，将组织切片机中的培养基排入烧杯中。使用涂布棒将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中例如，接种环）。将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO₂，100% 湿度）。在洗涤步骤前，让培养基预热至适宜温度。
    注意： 所有后续步骤均在无菌条件下进行。
15. 将细胞滤网放入培养皿中用于洗涤PCLS。使用10 mL血清移液管通过细胞滤网完全移除培养基，并加入25 mL预热至37 °C的新鲜培养基。每30分钟重复此步骤3–4次。     
    注意： 细胞滤网可防止切片被吸入移液管中，从而避免切片受损。
16. 将肺组织切片小心转移至24孔培养板中，每孔加入至少500 µL培养基，每孔放置两片肺切片。将肺组织暴露于待测物质中（见步骤3.1–3.4）。 例如，37 °C、5% CO₂条件下培养24小时₂.      
    注意： 转移时，建议使用接种环，并让组织切片漂浮到环上，以避免组织损伤。无需进一步分离切片，因为只有新鲜培养基不足才会导致组织切片中的细胞死亡。组织切片在孔中可以相互重叠或接触，这不会影响组织的活性。
17. 将所有残留的人体材料放入一个装有固定剂的塑料瓶中（例如，10% 缓冲甲醛）至少 24 小时，随后在处理过程中焚烧。
    注意： 甲醛具有毒性，此步骤需在通风橱中进行。

2. 物质溶液的制备

注意：请在使用前立即配制工作溶液和对照品。

注意：应根据安全说明操作物质；若安全信息未知，则视为可能有害物质，并遵循常规安全预防措施。

1. 将水溶性物质直接溶解于培养基中。对于不溶或难溶的化学物质，应根据其溶解性，先将其溶解于适当的溶剂中。水溶性有限的物质（<0.1 mg/mL）可例如用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇溶解。非毒性溶剂浓度应事先通过滴定确定。确保物质在稀释至培养基后不会从溶液中析出。
   注意：六氯铂酸铵（HClPt）和月桂醇聚醚硫酸钠（SLS）溶液已配制完成。
2. 在培养基或溶剂中配制浓度为所需最高浓度100倍的储备液。称取12.5 mg HClPt和34.4 mg SLS，分别加入1 mL培养基中溶解，制备储备液。
   注意：这些化学品无需使用溶剂。
3. 用预热的培养基进行1:100的最终稀释。若此前使用了溶剂，此方法可确保所有浓度下的待测物质具有相同的最终溶剂浓度。
4. 使用最终溶剂浓度（例如，如步骤3.3所述的1%）作为PCLS的对照处理。对于结果部分提到的化学品，无需设置溶剂对照。

3. 细胞毒性检测的阳性和阴性对照

1. 进行所有活力检测时，需准备以下阳性和阴性对照：
   1. 组织对照：将PCLS仅在培养基中孵育，作为未处理PCLS的参照，于细胞培养条件（37 °C、5% CO₂、100%湿度）下孵育24小时。
   2. 溶剂对照（如需要）：将PCLS与最终浓度的溶剂共同孵育，作为仅用溶剂处理的PCLS参照（见步骤3.4），于细胞培养条件（37 °C、5% CO₂、100%湿度）下孵育24小时。
   3. 阳性对照：将PCLS在缓冲液中与1%去垢剂于4 °C孵育1小时。
      注意：若PCLS变为无色，则表明组织已死亡。上清液中总L-乳酸脱氢酶（LDH）的吸光度约为1.9–2.3。该组织用于WST-1检测，其吸光度约为0。

4. 采用水溶性四唑盐（WST-1）法测定化学物质诱导的人肺组织切片细胞毒性

注意： WST-1 检测在 24 孔板中进行，每孔放置两个肺切片（PCLS）。建议每个参数设置重复孔，并在检测后合并这些重复孔的结果。

1. 在开始前立即用培养基稀释WST-1试剂，配制工作液。每孔所需工作液体积为24孔板每孔250 µL。因此，每孔将25 µL试剂与225 µL培养基混合。
2. 完成步骤1.16中PCLS的孵育后，弃去或收集上清液用于细胞因子检测或其他检测（如LDH检测）。剩余组织用于下一步操作。
3. 每孔加入250 µL WST-1工作液，于37 °C、5% CO₂ 条件下孵育1小时。确保孵育期间PCLS完全被WST-1试剂覆盖。
4. 将培养板置于轨道摇床上（200 rpm），轻轻振荡30秒以确保WST-1试剂充分混匀。取一个新的平底96孔板，从24孔板每孔的上清液中各取100 µL，每样本设两个复孔。
5. 使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度（参考波长：630 nm），并用450 nm吸光度减去630 nm吸光度。注意：仅当组织具有活性时，才能获得可靠的细胞毒性评估数据。因此，每次实验均应满足上述已发表的可接受标准。若未达到这些标准，则应重复实验。
6. 未处理的培养基对照吸光度应高于0.6，否则应重复实验。若数据满足此要求，则将组织对照组的吸光度设为100%，并据此计算处理样本相对于组织对照的WST-1还原率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶管 3.0 × 5.0 mm	A. Hartenstein (Leipzig, Germany)	SS04
注射器	Faust Lab Science (Klettgau, Germany)	9.410 050
取芯工具	定制	定制
修整刀片手柄（FEATHER）	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205530001
修整刀片（FEATHER）	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205500000
切片机：组织切片器	Alabama R&D (Bad Homburg, Germany)	303400-ADPT	Krumdieck 组织切片器 (MD6000)
切片机刀片	Wilkinson Sword (Solingen, Germany)	ENR-4027800011506
细胞筛滤器（100 µm 尼龙）	Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)	BD352360
接种环	Copan Diagnostics (Murrieta, USA)	CD176S01
TPP 组织培养板，24 孔	Sigma (München, Germany)	Z707791-126EA
Nunc MaxiSorp 平底板	Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)	44-2404-21
Nunc MicroWell 96 孔板	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	260836
多功能酶标仪	Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland)	Tecan infinite F200Pro	酶标仪
微孔板振荡器	Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)	KM-2 Akku
检测试剂盒
细胞增殖检测试剂 WST-1	Roche (Basel, Switzerland)	11644807001
试剂
低凝胶温度琼脂糖	Sigma (München, Germany)	A9414-100G
平衡盐混合物与溶液，细胞培养，经典培养基与盐类，Earle's 平衡盐溶液（EBSS）	Sigma (München, Germany)	E2888-500ML
青霉素和链霉素	Lonza (Verviers, Belgium)	17-602E
Dulbecco 改良 Eagle 培养基营养混合物 F-12 Ham（DMEM F-12）	Gibco (Darmstadt, Germany)	11039-047	培养基
含钙镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Lonza (Verviers, Belgium)	BE17-513F	缓冲液
去垢剂	Sigma (Saint Louis, USA)	X100-100ML	Triton X-100