所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行
1. 人肺组织切片的常规制备及后续化学物质暴露
注意：填充肺脏需要两人协作完成。建议操作人员具备最新的甲型和乙型肝炎疫苗接种记录。在肺移植前，患者通常会常规筛查丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）。若诊断或怀疑存在Mycobacterium tuberculosis的活动性感染，则应弃用该肺脏。然而，所有新鲜的人肺组织及其衍生样本均应视为具有潜在传染性，并必须采取相应的防护措施（如颗粒过滤口罩（FFP2）、防护眼镜、手套），以确保工作人员的职业安全。该操作过程耗时60至90分钟。
- 确认人肺叶的完整性。
注意： 胸膜撕裂会阻碍组织的均匀灌注。人肺组织必须取自手术切除当天。在冰上用琼脂糖灌注前，组织在室温下保存约2小时是可接受的。本方案所用的组织来自接受肺切除术的患者，而非来自已故患者。若组织曾置于冰上保存，灌注前需先将其预热至室温，否则琼脂糖会立即聚合，无法实现均匀灌注。
注意： 确保所有接触人体原代材料的人员穿戴防护服，包括实验服、两副手套、帽子、口罩和一副护目镜。人体材料可能具有感染性。
- 称取7.5 g低熔点琼脂糖，加入250 mL重蒸水中。在微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。根据琼脂糖的熔点和凝固点，冷却至约40 °C。
注意： 根据肺叶大小，需要若干个烧瓶。
- 预热并保持培养基（材料表) 在 37 °C 下。
注意： 如果琼脂糖温度过高，培养基中的维生素将失活，细胞也会受到损伤。如果培养基/琼脂糖溶液的温度低于37 °C，凝胶过程将提前启动，影响肺组织的均匀灌注。仅建议使用37 °C至39 °C的温度范围。
- 开始操作前将所有所需材料置于触手可及之处：5至10个夹子、一根长约1米的软质导管、一支合适的注射器（例如，50 mL）以连接导管，以及装有冰块的冰盒。
- 通过插入硅胶管插管气管/主支气管，并使用与硅胶管平行方向的夹子固定，使夹子沿硅胶管侧向压紧组织，但不夹闭硅胶管。确认硅胶管已牢固固定于内部，在灌注过程中不会滑脱。使用夹子封闭所有其他支气管、血管及损伤部位，防止灌注过程中琼脂糖泄漏。
- 在烧杯中将等体积的3%低凝胶琼脂糖与培养基混合。使用50 mL注射器将混合物注入肺部。在用培养基重新填充注射器前，需用手指或夹子夹闭导管，以避免产生气泡及琼脂糖反流。持续灌注至肺叶完全膨胀。轻轻触碰肺侧面的胸膜，胸膜应感觉平整且坚实。
注意： 根据肺叶的大小，可能需要最多 2 至 3 L 的琼脂糖/培养基溶液。
- 若单个标本中包含多个支气管，则对每个支气管重复步骤 1.5 - 1.6。
- 将肺置于冰上，使灌注的琼脂糖凝固成胶，时间根据琼脂糖用量而定，通常为20至40分钟。轻轻触碰胸膜多个部位，检查是否变硬且冰凉，若符合则表明聚合已完成；否则需继续等待。病理学家将把肺切成片状，取样后将肺组织置于冰上保存，以便运输。
- 用锋利的刀片将人肺组织切成 3 - 5 cm 的组织块。
注意： 每次处理肺组织时均使用新刀片，以确保锋利。
- 将400 mL冰冻的Earle's平衡盐溶液（EBSS）注入组织切片机中。使用半自动螺丝刀配合所需直径的取芯工具，立即从肺组织切片中切取圆柱形组织芯例如，8 mm；10 mm。
注意：此直径必须与仪器内组织固定器的直径相等。
- 调整肺组织切片的厚度至所需值。
注意： 通常在PCLS实验中使用约250 µm的厚度。组织切片机制造商推荐使用其组织切片厚度测量仪来验证切片厚度。或者，也可采用整体染色结合共聚焦显微镜的方法测定切片厚度，具体方法如Brismar所述。 等27
- 将组织芯转移至组织切片机的组织架中。将组织架的配重块置于组织芯上方。将组织切片机的臂速和刀速均设置为6。开始将组织芯切割成肺切片（PCLS）。
- 将500 mL市售的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）：营养混合物F-12 DMEM/F12（1:1）加入5 mL青霉素（10,000单位/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）。将培养基在无菌条件下置于冰箱中保存数天。仅预热所需体积的培养基。
注意： 青霉素在37 °C长时间保存会失活。应使用无血清且无染料的培养基，因为血清成分存在批次间差异，而染料（如酚红）可能干扰实验检测。
- 用25 mL冰冻培养基填充一个培养皿（100 × 15 mm）。通过打开玻璃圆筒上的夹子，将组织切片机中的培养基排入烧杯中。使用涂布棒将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中例如，接种环）。将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO2，100%湿度）中。在洗涤步骤前，使培养基充分预热。
注意： 所有后续步骤均在无菌条件下进行。
- 将细胞滤网放入培养皿中用于洗涤PCLS。使用10 mL移液管通过细胞滤网彻底移除培养基，并加入25 mL预热至37 °C的新鲜培养基。每30分钟重复此步骤3–4次。
注意： 细胞滤网可防止切片被吸入移液管中，从而避免切片受损。
- 将肺组织切片小心转移至24孔培养板中，每孔加入至少500 µL培养基，每孔放置两个切片。将肺组织暴露于待测物质中（见步骤3.1–3.4）。 例如，37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
注意： 转移时，建议使用接种环，并让组织切片漂浮到接种环上，以避免组织损伤。无需进一步分离切片，因为只有新鲜培养基不足才会导致组织切片中的细胞死亡。组织切片在孔中可以相互重叠或接触，这对组织活力无任何影响。
- 将所有残留的人体材料放入一个装有固定剂的塑料瓶中（例如，10% 缓冲甲醛）至少 24 小时，并在处理过程中焚烧。
注意：甲醛具有毒性，此步骤需在通风橱中进行。
2. 物质溶液的制备
注意：请在使用前立即配制工作溶液和对照品。
注意：应根据安全说明操作物质；若安全信息未知，则视为可能有害，并遵循常规安全预防措施。
- 将水溶性物质直接溶解于培养基中。对于不溶或难溶性化学品，应根据物质的溶解性，先将其溶解于适当的溶剂中。水溶性有限的物质（<0.1 mg/mL）可例如用DMSO或乙醇溶解。应通过预实验滴定确定溶剂的无毒浓度范围。确保物质在稀释至培养基后不会从溶液中析出。
注意： HClPt 和月桂醇聚醚硫酸钠（SLS）溶液已配制完成。
- 将受试物质的储备液配制成培养基或溶剂中目标最高浓度的100倍。称取12.5 mg HClPt 和 34.4 mg SLS，用1 mL 培养基溶解，制备储备液。
注意： 这些化学品无需使用溶剂。
- 用预热的培养基进行1:100的最终稀释。若此前使用了溶剂，此方法可确保所有浓度下的受试物质具有相同的最终溶剂浓度。
- 使用最终的溶剂浓度（例如，如步骤2.3中所述的1%）作为PCLS的对照处理。对于结果部分提及的化学品，无需设置溶剂对照。
3. 细胞毒性检测的阳性和阴性对照
- 进行所有活力检测时，准备以下阳性和阴性对照：
- 组织对照：将PCLS仅在培养基中孵育，作为未处理PCLS的参照，于细胞培养条件（37 °C、5% CO2、100%湿度）下孵育24小时。
- 溶剂对照（如需要）：将PCLS与最终浓度的溶剂共同孵育，作为仅用溶剂处理的PCLS参照（参见步骤1.4），于细胞培养条件（37 °C、5% CO2、100%湿度）下孵育24小时。
- 阳性对照：将PCLS在缓冲液中与1%去垢剂于4 °C孵育1小时。
注意：若PCLS变为无色，则表明组织已死亡。上清液中总L-乳酸脱氢酶（LDH）的吸光度约为1.9 - 2.3（参见步骤4.1 - 4.4）。
4. 乳酸脱氢酶（LDH）检测
注意： 乳酸脱氢酶（LDH）检测在孵育后阶段结束时，总体积为100 µL培养上清液，于96孔板中进行。
- 孵育PCLS样本（含或不含测试试剂）后，从步骤1.16中取50 µL上清液，重复两份转移至新的96孔板中。由此可从24孔板的每个处理孔中获得两个重复样本。
- 在测定前立即配制LDH试剂的工作液。工作液由催化剂溶液（将冻干粉溶于1 mL双蒸水中）和试剂盒提供的染料溶液组成。对于一块96孔板，将125 µL催化剂溶液与6.25 mL染料溶液充分混合。
注意： 避免将溶液暴露于直射光下。
- 将50 µL工作液加入已含有50 µL上清液的各孔中，于室温避光孵育20分钟。无需进一步混匀。
- 使用酶标仪在492 nm波长下测定各孔的吸光度（参考波长：630 nm），并从492 nm吸光度值中减去630 nm的吸光度值。这些数值将用于3.5步骤的计算。
注意： 只有来自存活组织的数据才能用于获得可靠的细胞毒性评估结果。经去垢剂处理的对照组吸光度应高于1。
- 分析时，以第2.1步中阳性对照的吸光度值为100%，计算处理样本相对于阳性对照的LDH释放量（即最大LDH释放量）。