一种基于荧光的检测方法：利用基因工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物

摘要

来源：Fouda, A.，等，一种基于荧光的淋巴细胞检测法，适用于小分子高通量筛选。J. Vis. Exp.，（2017）。

本视频展示了通过基于荧光的检测方法筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理表达绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的转基因小鼠来源的T淋巴细胞。增强或减弱的GFP信号可分别用于识别这些化合物的刺激或抑制作用。

方案

1. 脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的制备

1. 所有步骤均须在经70%乙醇清洁的生物安全柜中进行。
2. 取出70 mL预热的RPMI 1640 1x培养基（商品化产品，以过滤灭菌的500 mL瓶装提供），置于无菌离心管中。该培养基将在后续实验步骤中使用。
3. 向剩余的430 mL RPMI 1640 1x培养基中添加50 mL灭活胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素、5 mL N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、5 mL非必需氨基酸、5 mL丙酮酸钠以及0.05 mL过滤除菌的（1 M）2-巯基乙醇。
   注意：使用设定为37 ºC的水浴锅预热脾细胞培养基，以避免细胞受热休克。此步骤至关重要，可防止细胞凋亡的诱导。
4. 为配制流式细胞术缓冲液，将2 mL FBS加入98 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制后冷藏保存，并建议在三天内使用完毕。

2. 从 Nur77^GFP 小鼠脾脏制备脾细胞悬液

1. 无菌条件下从一只6-8周龄的雌性Nur77^GFP 小鼠中分离脾脏。
   1. 操作时应在无菌操作台内进行。将已处死的小鼠体表毛发、剪刀和镊子浸泡于70%乙醇中。
   2. 将小鼠置于右侧卧位，切开左上腹部的皮肤和肌肉，观察切口区域以明确脾脏位置，随后将其切除。将脾脏置于冰上含有脾细胞培养基的容器中，待下一步操作时使用。
2. 将脾脏组织放入含有5 mL预温脾细胞培养基的10 cm² 细胞培养培养皿中。
3. 使用无菌注射器活塞研磨脾脏，直至溶液变浑浊。操作结束时应残留脾脏胶原基质。
4. 在脾细胞培养基中充分研磨后，收集细胞悬液，并通过置于50 mL离心管上的70 µm细胞筛网过滤，以去除碎片或凝块。
5. 以500 × g 离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于2-3 mL自制或商用的红细胞裂解缓冲液中。吹打混匀2-3次后，静置20-30秒。
6. 加入5 mL PBS或所选合适缓冲液，然后以500 × g 离心5分钟。
7. 移除上清液（应呈红色，因含有裂解的红细胞），并将细胞沉淀重悬于2 mL脾细胞培养基中。
8. 使用血细胞计数板，对经台盼蓝染色的细胞进行计数，以区分活细胞与死细胞（坏死细胞）。

3. 从脾细胞悬液中分离T细胞

1. 将细胞悬液在 500 × g 条件下离心 5 分钟。用无血清 RPMI 培养基（来自步骤 1.3 的 50 mL）重悬细胞，使细胞浓度达到 10 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 将细胞转移至一个 5 mL 聚苯乙烯管中，并预留 100 µL 脾细胞悬液，用于纯化步骤结束后的纯度评估/比较。
3. 向细胞悬液中加入正常大鼠血清，终浓度为 50 µL/mL，随后加入 T 细胞分离抗体混合物（50 µL/mL）。
4. 混匀细胞悬液，静置 10 分钟。此步骤可使抗体混合物结合所有非目标细胞。
5. 加入链霉亲和素快速磁珠（磁性微珠）孵育 2.5 分钟，然后用无血清培养基将体积补至 2.5 mL。
6. 将试管置于细胞分离磁铁中 3 分钟。
7. 保持磁铁吸附状态，一次性倾倒出上清液，将 T 细胞悬液转移至新的聚苯乙烯管中。
   注意： 所得的上清液中含有纯化的 T 细胞。所有非目标细胞则被磁性链霉亲和素微珠结合并吸附在管壁上。
8. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对分离得到的 T 细胞进行计数。
   注意： 在此步骤中，可通过流式细胞术分析 T 细胞分离前后 CD3⁺ 细胞所占比例，以验证分离后 T 细胞的纯度（可选）。
   1. 简要步骤：将 1 mL 脾细胞悬液在 500 × g 条件下短暂离心。弃去上清液，将细胞重悬于流式细胞术缓冲液中，调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
   2. 加入荧光标记的抗小鼠 CD3 抗体，稀释比例为 1:100。4 °C 避光孵育 30 分钟。洗涤一次，离心后重悬于流式细胞术缓冲液（400 µL）中，用于流式细胞术分析。

4. T细胞活化与绿色荧光蛋白（GFP）表达的诱导

1. 将T细胞以悬浮状态接种于圆底96孔板中，细胞浓度为2.5 × 10⁵ 个细胞/孔。
2. 加入重组白细胞介素（IL）-7，终浓度为2 ng/mL，并加入CD3/CD28磁珠（每10⁶ 个细胞加入25 µL）。保留部分T细胞不加磁珠处理，作为后续检测中的阴性对照，以代表未活化的T细胞。
3. 12小时后，通过轻轻吹打每孔中的细胞悬液，使磁珠-细胞复合物或聚集体解离，从而从96孔板中收集T细胞。将所有孔中的悬液收集至一个5 mL聚苯乙烯管中。
4. 将含有细胞悬液的管子放入之前用于T细胞纯化的同一细胞分离磁架中，静置5分钟。
5. 保持磁铁位置不动，一次性倾倒出液体，将T细胞悬液转移至新的聚苯乙烯管中。
6. 以500 × g 离心5分钟。弃上清后，用新鲜的脾细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2 × 10⁶ 个细胞/mL。
7. 在刺激后12至24小时，通过流式细胞术检测GFP表达强度（可选，用于质量控制），并与未活化的T细胞进行比较。¹²
   注意： GFP荧光为Nur77^GFP  T细胞的内在特性，在T细胞受体（TCR）成功激活后即会显现。
8. 如需通过显微镜评估细胞活力和活化状态（可选），可在分析前30分钟用Hoechst染色活化细胞，染色浓度为0.2 µg/mL。取适量细胞悬液加入盖玻片或平底黑色侧壁384孔板的孔中，在荧光显微镜下观察活细胞。死细胞无法保留细胞核染色。

5. 小分子高通量筛选（HTS）

1. 将活化的T细胞（磁珠或抗体/CD40L）或非活化组的细胞制备成浓度为2 × 10⁶ 个细胞/mL的单细胞悬液。
2. 在384孔板中每孔接种75,000个细胞（体积为40 µL）。使用平底黑色侧壁384孔板或显微镜盖玻片，通过Hoechst染色进行荧光显微镜检测，以评估细胞活力和活化状态（可选的质量控制步骤，用于高通量筛选前的质量控制）（详见步骤4.8）。
3. 手动或使用自动化系统，向各孔中加入所选药物（溶于0.5%二甲基亚砜，DMSO）。
4. 向阳性对照孔（活化组）和阴性对照孔（非活化组）中加入溶剂对照（DMSO），并将DMSO终浓度调整至不超过0.5%。
5. 将培养板置于37 ºC、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育24小时（或根据实验需求设定孵育时间）。
6. 在筛选当天，将Hoechst 33342染色液按1:3,333稀释（ 例如，向384孔板中每孔加入10 µL染色液，使终体积为50 µL）；在进行GFP分析前30分钟加入Hoechst溶液，使其终浓度为0.2 µg/mL。
7. 轻柔吹打各孔细胞，使其在孔内均匀分布。
   注意：若在步骤5.3中使用自动化系统加药，此步骤尤为重要，因为细胞容易在孔的一侧聚集，位置通常与液体流动方向相反。
8. 在室温下以45 × g 离心3分钟。
9. 将培养板在室温下静置15分钟。
10. 使用自动化共聚焦高内涵筛选（HCS）系统进行读板操作。 将培养板装入仪器，物镜设置为40倍或更高放大倍数。Hoechst检测使用相机#4（紫外光源），GFP检测使用相机#1（488 nm激光）。设置每孔读取6–10个视野，并调整仪器对每个视野依次在488 nm（用于检测GFP）和紫外光（用于检测Hoechst）下进行两次连续成像。物镜设置为40倍或更高放大倍数。
    注意：该系统为计算机控制的显微镜，无需手动调节。焦距、入射光强度和曝光时间均由仪器自动设定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nur77GFP 小鼠	The Jackson Laboratory	小鼠品系编号 016617	在本单位动物设施内建立了自繁种群
96 孔 U 型培养板，无菌	VWR International	10062-902	使用磁珠活化 T 细胞
70 µm 细胞筛，无菌	Corning Inc.	352350	制备脾细胞悬液
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，无菌	Corning Inc.	352058	制备脾细胞悬液
50 ml 聚丙烯锥底离心管，无菌	VWR International	89039-656	制备脾细胞悬液
10 ml 无针头注射器，无菌	Becton, Dickinson and Company	305482	用于研磨脾脏
5 ml 细胞培养皿，无菌	Greiner Bio-One	627 160	用于研磨脾脏
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	WISENT Inc.	450-200-EL	脾细胞培养基组分
含碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺的 RPMI 1600 培养基	WISENT Inc.	350-002-CL	脾细胞培养基组分
MEM 非必需氨基酸	WISENT Inc.	321-010-EL	脾细胞培养基组分
HEPES 游离酸（1 M）	WISENT Inc.	330-050-EL	脾细胞培养基组分
丙酮酸钠溶液（100 mM）	WISENT Inc.	600-110-EL	脾细胞培养基组分
胎牛血清（FBS）	WISENT Inc.	080-910	脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液组分
磷酸盐缓冲液（PBS）	WISENT Inc.	311-010-CL	流式细胞术缓冲液组分
2-巯基乙醇（55 mM）	Thermo Fisher Scientific	21985-023	脾细胞培养基组分
T 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19851	用于分离 T 细胞
小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28 超顺磁性磁珠	Thermo Fisher Scientific	11452D	用于活化 T 细胞
细胞分离磁铁	Stemcell Technologies	18000	用于分离 T 细胞及去除磁珠
重组小鼠 IL-7	Peprotech	217-17	在 T 细胞活化期间支持其存活
抗小鼠 CD3 抗体	BD Pharmingen	561799	用于流式细胞术染色 T 细胞
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	孵育 24 小时后重悬细胞
Opera Phenix 高内涵筛选系统	PerkinElmer Inc.	HH14000000	用于分析 GFP/Hoechst 信号