一种基于荧光的检测方法：利用基因工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物

摘要

来源：Fouda, A.，等，一种基于荧光的淋巴细胞检测法，适用于小分子高通量筛选。J. Vis. Exp.，（2017）。

本视频展示了通过基于荧光的检测方法筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理表达绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的转基因小鼠来源的T淋巴细胞。增强或减弱的GFP信号可分别用于识别这些化合物的刺激或抑制作用。

方案

1. 脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的制备

1. 所有步骤均须在经70%乙醇清洁的生物安全柜中进行。
2. 取出70 mL预热的RPMI 1640 1x培养基（商品化产品，以过滤灭菌的500 mL瓶装提供），置于无菌离心管中。该培养基将在后续实验步骤中使用。
3. 向剩余的430 mL RPMI 1640 1x培养基中添加50 mL灭活胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素、5 mL N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、5 mL非必需氨基酸、5 mL丙酮酸钠以及0.05 mL过滤除菌的（1 M）2-巯基乙醇。
   注意：使用设定为37 ºC的水浴锅预热脾细胞培养基，以避免细胞受热休克。此步骤至关重要，可防止细胞凋亡的诱导。
4. 为配制流式细胞术缓冲液，将2 mL FBS加入98 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制后冷藏保存，并建议在三天内使用完毕。

2. 从 Nur77^GFP 小鼠脾脏制备脾细胞悬液

1. 无菌条件下从一只6-8周龄的雌性Nur77^GFP 小鼠中分离脾脏。
   1. 操作时应在无菌操作台内进行。将已处死的小鼠体表毛发、剪刀和镊子浸泡于70%乙醇中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nur77GFP 小鼠	The Jackson Laboratory	小鼠品系编号 016617	在本单位动物设施内建立了自繁种群
96 孔 U 型培养板，无菌	VWR International	10062-902	使用磁珠活化 T 细胞
70 µm 细胞筛，无菌	Corning Inc.	352350	制备脾细胞悬液
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，无菌	Corning Inc.	352058	制备脾细胞悬液
50 ml 聚丙烯锥底离心管，无菌	VWR International	89039-656	制备脾细胞悬液
10 ml 无针头注射器，无菌	Becton, Dickinson and Company	305482	用于研磨脾脏
5 ml 细胞培养皿，无菌	Greiner Bio-One	627 160	用于研磨脾脏
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	WISENT Inc.	450-200-EL	脾细胞培养基组分
含碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺的 RPMI 1600 培养基	WISENT Inc.	350-002-CL	脾细胞培养基组分
MEM 非必需氨基酸	WISENT Inc.	321-010-EL	脾细胞培养基组分
HEPES 游离酸（1 M）	WISENT Inc.	330-050-EL	脾细胞培养基组分
丙酮酸钠溶液（100 mM）	WISENT Inc.	600-110-EL	脾细胞培养基组分
胎牛血清（FBS）	WISENT Inc.	080-910	脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液组分
磷酸盐缓冲液（PBS）	WISENT Inc.	311-010-CL	流式细胞术缓冲液组分
2-巯基乙醇（55 mM）	Thermo Fisher Scientific	21985-023	脾细胞培养基组分
T 细胞分离试剂盒	Stemcell Technologies	19851	用于分离 T 细胞
小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28 超顺磁性磁珠	Thermo Fisher Scientific	11452D	用于活化 T 细胞
细胞分离磁铁	Stemcell Technologies	18000	用于分离 T 细胞及去除磁珠
重组小鼠 IL-7	Peprotech	217-17	在 T 细胞活化期间支持其存活
抗小鼠 CD3 抗体	BD Pharmingen	561799	用于流式细胞术染色 T 细胞
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	孵育 24 小时后重悬细胞
Opera Phenix 高内涵筛选系统	PerkinElmer Inc.	HH14000000	用于分析 GFP/Hoechst 信号