使用工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物的基于荧光的测定

Abstract

来源:Fouda， A. 等人，适用于小分子高通量筛选的基于荧光的淋巴细胞测定。J. Vis. Exp.，（2017 年）。

该视频演示了通过基于荧光的分析筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理具有绿色荧光蛋白表达盒的转基因小鼠来源的 T 淋巴细胞。增强和减少的 GFP 信号能够分别识别化合物的刺激和抑制作用。

Protocol

1. 脾细胞培养基和流式细胞术缓冲液的制备

1. 在 70% 乙醇清洁的生物罩下执行所有步骤。
2. 取出 70 mL 预热的 Roswell Park Memorial Institute （RPMI） 1640 1x 培养基（市售，以过滤的 500 ml 体积无菌瓶提供）并放入无菌管中。去除的培养基将在实验步骤的后面使用。
在
3. 剩余的 430 mL RPMI 1640 1x 中补充 50 ml 灭活胎牛血清 （FBS）、5 mL 青霉素/链霉素、5 mL N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸 （HEPES）、5 mL 非必需氨基酸、5 mL 丙酮酸钠和 0.05 mL 过滤 （1M） 2-巯基乙醇><。 注意:使用设置为 37 ºC 的水浴预热脾细胞培养基，以避免热休克细胞。这对于避免诱导细胞凋亡很重要。
4. 要制备流式细胞术缓冲液，请将 2 mL FBS 添加到 98 ml 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并冷藏直至使用（最好在三天内）。

2. Nur77^GFP 小鼠脾脏生成脾细胞悬液

1. 无菌分离 6-8 周龄雌性 Nur77^GFP 小鼠的脾脏。
   1. 为此，请在无菌罩下工作。将牺牲的小鼠皮毛、剪刀和镊子浸泡在 70% 乙醇中。
   2. 将鼠标放在右侧，切开左上腹象限的皮肤和肌肉。检查切口区域以明显定位脾脏，然后将其切出。将脾脏保存在冰上的脾细胞培养基中，直到准备好进行下一步。
2. 将脾脏放入含有 5 ml 预热脾细胞培养基的 10 cm² 细胞培养皿中。
3. 使用无菌注射器柱塞捣碎脾脏，直到溶液浑浊。手术结束时应保留脾胶原基质。
4. 在脾细胞培养基中大量混合后，收集细胞悬液并将其通过放置在 50 mL 试管上的 70 μm 细胞过滤器，以过滤掉任何碎片或凝块。
5. 以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 2-3 mL 内部生产或市售的红细胞裂解缓冲液中。移液后（2-3 次），让悬浮液静置 20-30 秒。
6. 加入 5 mL PBS 或合适的缓冲液，然后以 500 x g 的离心力将细胞悬液离心 5 分钟。
7. 去除上清液（应为红色，因为它含有裂解的红细胞）并将细胞沉淀重悬于 2 ml 脾细胞培养基中。
8. 使用血细胞计数器，计数台盼蓝染色的细胞数量，以区分活细胞和死细胞（坏死）。

3. 从脾细胞悬液中分离 T 细胞

1. 将细胞悬液以 500 x g 离心 5 分钟。 将细胞重悬于无血清 RPMI 培养基（步骤 1.3 中的 50 mL）中，以获得 10 x 10⁶ 个细胞/mL 的细胞浓度。
2. 将细胞转移至 5 mL 聚苯乙烯管中，并留出 100 μL 等分试样的脾细胞，用于纯化步骤结束时的纯度评估/比较。
3. 向细胞悬液中加入 50 μL/mL 的正常大鼠血清，然后加入 T 细胞分离抗体混合物 （50 μL/mL）。
4. 混合细胞悬液并静置 10 分钟。此步骤允许抗体混合物结合所有不需要的细胞。
5. 加入链霉亲和素快速球体（磁珠）2.5 分钟，然后使用无血清培养基将体积调至 2.5 mL。
6. 将试管放入细胞分离磁体中 3 分钟。
7. 握住磁铁，将 T 细胞悬液转移到新的聚苯乙烯管中，并一次性倒出溶液。
   注意:分离的悬浮液包含纯化的 T 细胞。所有不需要的细胞都保持在与磁性链霉亲和素珠结合的试管一侧。
8. 使用台盼蓝和血细胞计数器对分离的 T 细胞进行计数。
   注意:在此步骤中，可以通过流式细胞术分析 T 细胞分离前后 CD3⁺ 事件的百分比来验证分离的 T 细胞的纯度（可选）。
   1. 简而言之，以 500 x g 离心 1 ml 脾细胞悬液。弃去上清液，将细胞以 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度悬浮在流式细胞术缓冲液中。
   2. 添加浓度为 1:100 的荧光标记抗小鼠 CD3 抗体。在 4 °C 孵育 30 分钟。洗涤一次，离心，然后重悬于流式细胞术缓冲液 （400 μL） 中，用于流式细胞术分析。

4. T 细胞活化和绿色荧光蛋白 （GFP） 表达的诱导

1. 将悬浮的 T 细胞以 2.5 x 10⁵ 个细胞/孔的浓度接种到圆底 96 孔板中。
2. 添加 2 ng/mL 的重组白细胞介素 （IL）-7 和 CD3/CD28 磁珠（25 μL/10⁶ 个细胞）。保留一部分 T 细胞未用珠子处理，作为以后测量代表未活化 T 细胞的阴性对照。
3. 12 小时后，通过轻轻上下吹打每个孔中的细胞悬液以打破任何珠细胞-细胞复合物/聚集体，从 96 孔板中收获 T 细胞。将所有孔中的悬浮液收集到 5 mL 聚苯乙烯管中。
4. 将含有悬浮液的试管放入先前用于纯化 T 细胞的相同细胞分离磁力架中，并静置 5 分钟。
5. 握住磁铁并一次性倒出溶液，将 T 细胞悬液转移到新的聚苯乙烯管中。
6. 以 500 x g 的离心力离心细胞 5 分钟。将细胞重悬于新鲜的脾细胞培养基中，以获得 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。
7. 与未活化的 T 细胞相比，在刺激后 12 至 24 小时通过流式细胞术（可选用于质量控制）评估 GFP 表达强度。¹²
   注意:GFP 荧光是 Nur77^GFP T 细胞固有的，在 T 细胞受体 TCR 成功激活时表现出来。
8. 为了通过显微镜评估活力和活化（可选），在分析前30分钟用Hoechst对活化的细胞进行染色，浓度为0.2μg/ ml。将足够体积的细胞悬液添加到平底黑色侧面384孔板的盖玻片或孔中，并在荧光显微镜下检查以评估活细胞。死细胞不会保留核染色。

5. 小分子的高通量筛选 （HTS）

1. 制备 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的活化 T 细胞（磁珠或抗体/CD40L）或未活化组的细胞悬液。
2. 在 384 孔板（体积为 40 μL）中接种 75,000 个细胞/孔。使用平底黑色面 384 孔板或显微镜盖玻片，使用 Hoechst 染色通过荧光显微镜（HTS 之前的可选质量控制步骤）进行活力和活化评估（有关详细信息，请参阅步骤 4.8）。
3. 手动或使用自动系统，将所选药物（溶于 0.5% 二甲基亚砜，DMSO）添加到每个孔中。
4. 将载体 （DMSO） 添加到阳性（活化）和阴性（非活化）对照孔中。将 DMSO 浓度调整至最大 0.5%。
5. 将板在 37 ºC 和 5% 二氧化碳、CO₂ 下孵育 24 小时（或选择的孵育时间）。
6. 在筛选当天，稀释 Hoechst 33342 染色溶液（1:3,333;例如，向 384 孔板中的细胞中加入 10 μL，以产生 50 μL 的总体积）。在 GFP 分析前 30 分钟，通过添加 Hoechst 溶液染色以达到 0.2 μg/mL 的浓度。
7. 轻轻地上下移液细胞，使细胞在每个孔中均匀分布。
   注意:在使用自动化系统分配药物（步骤 5.3）的情况下，此步骤很重要，因为细胞倾向于在孔的一侧积聚，与流动方向相反。
8. 在室温下以 45 x g 旋转板 3 分钟。
9. 将板在室温下静置 15 分钟。
10. 使用自动共聚焦高内涵筛选 （HCS） 系统进行板读数。将板加载到机器上。将物镜设置为 40 倍或更高的放大倍率。将相机 #4 用于 Hoechst（紫外线灯），将相机 #1 用于 GFP（激光 488）。将机器设置为每孔读取 6-10 个字段。调整机器，在 488 nm（读取 GFP）和紫外光（读取 Hoechst）处对每个场进行两次连续读数。将物镜设置为 40 倍或更高的放大倍率。
    注意:该系统是一台计算机化的显微镜，不需要任何调整。焦距、入射光强度和曝光时间均由机器自动设置。

Materials