利用磁力悬浮法检测人血液样本中的恒河猴因子

摘要

来源：Thompson, L. 等，利用磁悬浮技术定量分析细胞密度与抗原特性 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了使用磁悬浮仪器检测血液样本中Rh（Rhesus）因子的方法。磁场根据密度对微珠和血细胞进行排列并使其悬浮。用抗Rh抗体处理样本后，会形成具有中间密度的微珠-细胞复合物，从而实现Rh阳性与Rh阴性红细胞的区分。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 仪器设置

注意：对悬浮细胞进行成像需要将两个沿 z 轴磁化的稀土钕磁铁以相同磁极相对的方式放置，以产生磁场。磁铁之间的距离可根据磁场强度和目标物密度进行调整。本实验中，磁铁之间留有 1 mm 的间隙，足以插入一根长 50 mm、横截面为 1×1 mm² 的方形玻璃毛细管。该装置采用 AutoCAD 设计并进行 3D 打印，设计文件可应要求提供。

1. 将显微镜侧放，确保完全水平。
   注意：由于磁体相对于聚光镜和物镜的位置关系，处于标准直立位置的显微镜无法直接用于成像悬浮物体。通过将显微镜完全水平侧放，可克服这一限制，使聚光镜能够将光线聚焦到毛细管中，物镜则可对悬浮于磁体之间的细胞进行成像，同时满足柯勒照明的要求。
2. 使用2至3个实验室升降台将显微镜支架支撑并调平于光学面包板台上。
3. 为减少振动，将光学面包板台置于橡胶减震脚垫上进行支撑。
4. 移除原有载物台，替换为一个紧凑型实验室升降台，用于调节磁悬浮装置的高度（y轴），以及两个单轴平移台；其中一个用于调节焦距（z轴），另一个用于扫描毛细管。
5. 使用两个微型光学支撑柱将磁悬浮装置固定在实验室升降台上。

2. 抗体与羧基微粒/微珠的结合（改编自PolyAn的实验方案）

注意：仅低密度珠（1.05 g/mL）需要包被用于恒河猴Rh阳性（Rh(+)）检测，而高密度和低密度珠均需包被用于细胞外囊泡的检测。

1. 取1 mg等价的珠子悬浮液，加入0.5 mL活化缓冲液（50 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，MES（分子量195.2，每1 mL含9.72 mg），pH 5.0，含0.001%吐温-20）中。
2. 加入12 µL新配制的1.5 M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）（分子量191.7，每1 mL含0.28755 g）和12 µL冰冻水中新配制的0.3 M 磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） （分子量217.14，每1 mL含0.0651 g）。
3. 将管子置于旋转摇床上，在室温下剧烈振荡1小时，以活化珠子表面的羧基。
4. 活化1小时后，加入0.5 mL偶联缓冲液（10倍浓度磷酸盐缓冲液，PBS，或0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7–9），终止活化反应。
5. 在20,000 x g 条件下离心10分钟，使珠子沉淀；若珠子难以沉淀，可使用0.45 µm离心管滤器。吸除上清液或滤过液。
6. 用1 mL 10倍浓度PBS按步骤2.5的方法洗涤珠子3次。
7. 按每毫克珠子加入25 µg抗体计算，将目标抗体与活化的珠子混合，最终抗体浓度为0.7–1.0 mg/mL，溶于10倍浓度PBS中。
8. 将管子置于低速旋转摇床上，在室温下轻轻滚动过夜，进行偶联反应。
9. 重复步骤2.5，用1 mL 10倍浓度PBS洗涤珠子两次。
10. 在pH 8.0的缓冲液中加入含0.02%吐温-20的1 M乙醇胺（98%原液浓度为16.2 M）0.5 mL，在室温下轻轻振荡孵育1小时。
11. 重复步骤2.5，用1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤珠子一次。珠子可保存于200 µL  DPBS中，4 °C保存，直至使用。
    注意：本实验流程可在此处暂停。

3. Rh阳性检测的血液采集与制备

1. 使用一次性采血针刺破 Rh(+) 供者的指尖，收集 10 µL 血液至 1 mL DPBS 中。
2. 用荧光细胞膜染料对 Rh+ 细胞进行染色。可选步骤：向 1 mL Rh+ 细胞悬液中加入 1 µL 荧光染料（1:1000 稀释）。
3. 将细胞与荧光染料在 37 °C 下孵育 15 分钟。
4. 以 5,600 x g 离心 15 秒使细胞沉淀，并用 1 mL DPBS 洗涤 3 次。最后重悬于 1 mL 含钙和镁的 Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) （HBSS++）中。
5. 使用一次性采血针刺破 Rh(-) 供者的指尖，收集 2 µL 血液。
   注意： 若需准备超过 2 个实验条件，请采集足够血液，使每个试管中可加入 1 µL Rh(-) 血液。
6. 准备必要的实验管：仅微珠管、免疫球蛋白 G（IgG）对照管、样品管。
   1. 仅微珠管：加入 174 µL HBSS++、1 µL IgG 对照微珠、1 µL 高密度微珠（1.2 g/mL）和 24 µL 500 mM Gd³⁺ （60 mM）。
   2. IgG 对照管：加入 172 µL HBSS++、1 µL IgG 对照微珠、1 µL 高密度微珠、1 µL Rh- 血液、1 µL 染色的 Rh+ 血液悬液和 24 µL 500 mM Gd³⁺。
   3. 样品管：加入 172 µL HBSS++、1 µL 抗-RhD 包被微珠、1 µL 高密度微珠、1 µL Rh- 血液、1 µL 染色的 Rh(+) 血液悬液和 24 µL 500 mM Gd³⁺。
      注意： 向 Rh 样品中添加高密度微珠作为参考。

4. 在磁力悬浮装置上分析细胞

1. 根据制造商说明启动仪器。
2. 将 50 µL 样品加入毛细管中，直至充满管体。使用毛细管密封剂密封毛细管两端，确保无气泡存在。
3. 将毛细管置于上下磁铁之间的支架中。调节载物台和焦距以获得最佳观察效果。
   注意：细胞/微珠达到磁平衡位置所需时间因密度和 Gd³⁺ 浓度而异，通常为 5–20 分钟。Gd³⁺ 浓度越高，所需时间越短。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物	Sigma Aldrich	M-2933	(MES)；活化缓冲液的组分
50×2.5×1 mm 磁铁，镍（Ni-Cu-Ni）镀层，N52 级，沿 5 mm（0.197"）厚度磁化	K&J Magnetics	Custom	用于磁悬浮装置的磁铁
毛细管密封剂（Critoseal）	Leica Microsystems	267620	用于封闭毛细管两端
离心管滤器（Corning Costar Spin-X）	Sigma Aldrich	CLS8163	用于洗涤微珠
紧凑型实验室升降台	Thorlabs	LJ750	用于调节磁悬浮装置
不含钙、镁的 DPBS	Gibco	14190-144	微珠悬浮液的溶液
乙醇胺	Sigma Aldrich	E9508-100ML	微珠洗涤步骤中使用
荧光质膜染料（CellMask Green）	Invitrogen	C37608	用于染色 Rh 阳性细胞
钆特醇注射液	ProHance	NDC 0270-1111-03	钆（Gd³⁺）；用于悬浮细胞的磁性溶液
HBSS++	Gibco	14025-092	样本制备用溶液
迷你系列支架固定环	Thorlabs	MSR2	用于将磁悬浮装置固定在实验升降台上
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC)；用于抗体偶联反应
正常兔 IgG 对照	R&D Systems	AB-105-C	用作微珠包被的对照条件
磷酸盐缓冲液（10X 溶液，pH 7.4）	Boston Bioproducts	BM-220	偶联缓冲液组分，用于洗涤步骤
聚山梨酯 20（Tween 20）	Sigma Aldrich	P7949-500ML	活化缓冲液组分
聚苯乙烯羧基聚合物	Bangs Laboratories	PC06004	高密度微珠（1.05 g/mL），用于抗体偶联
兔抗 RhD 多克隆抗体	Invitrogen	PA5-112694	用于包被微珠以检测红细胞中的 Rh 因子
科研级显微镜	Olympus	Provis AX-70	用于安装磁悬浮装置并观察悬浮细胞的显微镜
橡胶减震脚垫	Thorlabs	RDF1	用于支撑面包板平台
方形硼硅玻璃管	VitroTubes	8100-050	用于将样本装入磁悬浮装置的毛细管
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	用于抗体偶联反应
平移台	Thorlabs	PT1	用于聚焦及扫描毛细管