使用磁悬浮法检测人血液样品中的 Rh 因子

摘要

来源:Thompson， L. et al.， 使用磁悬浮对细胞密度和抗原特性进行定量。J. Vis. Exp.（2021 年）

该视频演示了如何使用磁悬浮仪器检测血液样本中的恒河猴 （Rh） 因子。磁场根据密度对齐和悬浮珠子和血细胞。用抗 Rh 抗体处理样品可形成中等密度的微珠细胞复合物，从而分化 Rh 阳性和 Rh 阴性红细胞。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 仪器设置

注意:对悬浮细胞进行成像需要将两个在 z 轴上磁化的稀土钕磁铁放置在彼此相对的同一磁极上，以产生磁场。磁体之间的距离可以根据磁场的强度和目标的密度进行定制。在这种情况下，磁体之间隔开了 1 mm 的空间，足以插入 50 mm 长的 1x1 mm 方形玻璃毛细管。该设备是使用 AutoCAD 设计进行 3D 打印的，可根据要求提供。

1. 将显微镜侧放，完全水平。
   注意:由于磁体相对于聚光镜和物镜的位置，放置在标准直立位置的显微镜不直接适合对悬浮物体进行成像。通过将显微镜侧放，完全水平，使聚光镜能够将光线聚焦到毛细管中，物镜对悬浮在磁体之间的细胞进行成像，同时保持科勒照明要求，从而绕过这一限制。
2. 使用 2 个或 3 个实验室千斤顶支撑和调平试验板台上的支架。
3. 为了限制振动，请用橡胶减震脚支撑面包板桌。
4. 拆下载物台，用一个紧凑的实验室千斤顶代替它，用于调整悬浮装置的高度（y 轴）和两个单轴平移平台;一个用于调整焦点（z 轴），第二个用于扫描毛细管。
5. 使用两个迷你系列光学柱将磁悬浮装置连接到实验室插孔。

2. 抗体与羧基微粒/微珠的结合（根据 PolyAn 的方案修改）

注:只有低密度微珠 （1.05 g/mL） 需要包被用于 Rh、Rh（+） 检测，但高密度和低密度微珠都用于检测细胞外囊泡。

1. 取出 1 mg 当量的磁珠悬浮液，加入 0.5 mL 活化缓冲液（50 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸，MES（MW195.2,9.72 mg，1 mL））pH 5.0 和 0.001% 聚山梨酯-20）中。
2. 在冰冷的水中加入 12 μL 新鲜制备的 1.5 M 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDC）（MW 191.7,0.28755 g，1 mL）和 12 μL 0.3 M 磺基-N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）（MW 217.14,0.0651 g，1 mL）。
3. 将试管放在轨道摇床上，并在室温下剧烈摇晃 1 小时以激活珠子上的羧基。
4. 1 小时后，通过添加 0.5 mL 偶联缓冲液（10x 磷酸盐缓冲盐水、PBS 或 0.1 M 磷酸盐 pH 7-9）终止活化。
5. 通过以 20,000 x g 离心 10 分钟来沉淀珠子，或者，如果珠子不能沉淀，则使用 0.45 μm 离心管过滤器。吸出上清液或流出液。
6. 如步骤 2.5 所示，用 1 mL 的 10x PBS 洗涤珠子 3 次。
7. 计算每 mg 微珠中 25 μg 抗体，并在 10X PBS 中将所需抗体与活化微珠混合至最终抗体浓度为 0.7-1.0 mg/mL。
8. 将管子放在低速设置的管子摇杆上。在室温下轻轻滚动试管过夜以进行偶联。
9. 重复步骤 2.5 并用 1 mL 的 10x PBS 洗涤珠子两次。
10. 在缓冲液 pH 8.0 和 0.02% 聚山梨酯-20 中用 0.5 mL 1 M 乙醇胺（98% 原液 = 16.2 M）在室温下洗涤 1 小时，同时轻轻摇动。
11. 重复步骤 2.5 并在 1 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中洗涤珠子一次。珠子可以在 4 °C 下储存在 200 μL 的 DPBS 中，直到需要。
    注意:该协议可以在此处暂停。

3. 采集和制备用于 Rh（+） 检测的血液

1. 使用一键采血装置，刺破 Rh（+） 供体的手指，将 10 μL 血液收集到 1 mL DPBS 中。
2. 用荧光质膜染色剂对 Rh + 细胞进行染色。或者，将 1 μL 荧光染料添加到 1 mL Rh+ 细胞悬液中（1:1000 稀释）。
3. 将细胞与荧光染料在 37 °C 下孵育 15 分钟。
4. 通过在 5,600 x g 下旋转 15 秒来沉淀细胞，并使用 1 mL DPBS 洗涤 3 次。重悬于 1 mL 含钙和镁 （HBSS++） 的 Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 中。
5. 使用一键采血装置，刺破 Rh（-） 供体的手指并采集 2 μL 血液。
   注意:如果准备 2 种以上的条件，则收集足够的血液，向每管中加入 1 μL Rh（-） 血液。
6. 准备必要的实验管:单独的磁珠、免疫球蛋白 G （IgG） 对照、样品。
   1. 单独磁珠:添加 174 μL HBSS++、1 μL IgG 对照磁珠、1 μL 高密度磁珠 （1.2 g/mL） 和 24 μL 500 mM Gd³⁺ （60 mM）。
   2. IgG 对照:添加 172 μL HBSS++、1 μL IgG 对照珠、1 μL 高密度珠、1 μL Rh-血、1 μL 染色的 Rh+ 血液悬浮液和 24 μL 500 mM Gd³⁺。
   3. 样品管加入 172 μL HBSS++、1 μL 抗 RhD 包被珠子、1 μL 高密度珠子、1 μL Rh-血、1 μL 染色的 Rh（+） 血悬液和 24 μL 500 mM Gd³⁺.
      注意:将高密度磁珠添加到 Rh 样品中以供参考。

4. 在磁悬浮装置上分析细胞

1. 根据制造商的说明执行仪器启动。
2. 将 50 μL 样品加载到毛细管中，直到管装满。用毛细管密封剂密封毛细管的末端，确保没有气泡。
3. 将毛细管装入顶部和底部磁力架之间的支架中。调整载物台和焦距以获得最佳观看效果。
   注意:细胞/磁珠可能需要 5-20 分钟才能达到磁平衡位置（基于其密度和 Gd³⁺ 浓度）。Gd³⁺ 的浓度越高，时间越短。

材料