一种研究 T 细胞与支持的平面脂质双层相互作用的体外技术

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 分离 CD4⁺ T 细胞进行图像分析

1. 从收集的样品中解冻含有 10⁷ 个冷冻外周血单核细胞 （PBMC） 或淋巴结单核细胞 （LNMC） 的 1 mL 等分试样。在无菌罩中，将解冻的细胞添加到 9 mL 补充有青霉素/链霉素和谷氨酰胺的 RPMI 中。
   1. 在 4 °C 下以 300 x g 离心细胞 10 分钟，吸出上清液并将细胞重悬于 5 mL 含有 10% FBS（完全培养基）的补充 RPMI 中。将细胞在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育过夜。
2. 第二天，根据制造商的说明，使用市售试剂盒通过阴性免疫磁性分选纯化 CD4 ⁺ T 细胞。
3. 为了测量新鲜纯化的 CD4⁺ T 细胞的数量，将 5 μL 细胞悬液与等体积的台盼蓝溶液混合。在血细胞计数器中加入细胞-台盼蓝混合物，并对血细胞计数器 5 个部分内的活细胞进行计数。
4. 取细胞数的平均值，确定原始细胞悬液中的细胞数:细胞数/1 mL = 平均计数 x 2 x 10⁴。如果分离的单元总数太少，则按原样使用单元而不进行计数。
5. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，并将其重悬于检测缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4、137 mM NaCl、2 mM Na₂HPO₄、5 mM D-葡萄糖、5 mM KCl、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂ 和 1% 人血清白蛋白）中，浓度为 10⁵ 个细胞/50 μL 或更低，并将细胞保持在 4 °C（1-2 小时），直到准备好在实验中使用。
6. 根据相关机构指南处理所有生物废物。
7. 如果需要作为对照细胞群，从脐带血 PBMC 中制备活化的 CD8 ⁺ T 细胞，将 10⁷ 个细胞放入 T25 培养瓶中的 5 mL 完全培养基中，分别覆盖有 10 μg/mL 和 1 μg/mL 的抗 CD3 和抗 CD28 抗体混合物。
8. 第二天，从培养瓶中取出活化的脐带血细胞，用新鲜的完全培养基洗涤 1 次，并在重组 IL-2 （100 U/mL） 存在下扩增细胞 2 周。
9. 根据制造商的说明，使用市售试剂盒通过阴性免疫磁性分选纯化脐带血 CD8 ⁺ T 细胞。计数细胞并将培养基更换到检测缓冲液中，如 LN 和 PB CD8⁺ T 细胞的步骤 1.3-1.6 中所述。

2. 制备平面脂质双层的组分

1. 如处所述制备 3 种脂质体:（a） 0.4 mM DOPC（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）脂质体，（b） 0.4 mM DOPC 脂质体，含有 33 mol% DOGS-NTA（1,2-二油酰-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]（铵盐））脂质，（c） 含有 4 mol% 生物素-Cap-PE（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素）（钠盐））的 0.4 mM DOPC 脂质体。
2. 如前所述制备 5% 酪蛋白溶液。
   1. 将 5 g 酪蛋白粉溶于 100 mL 超纯水中，并加入 350 μL 10 M 氢氧化钠。根据可用规模，在常规磁力搅拌器上以缓慢的速度搅拌所有物质，在室温下搅拌 2 小时，然后在 4 °C 下过夜。将 pH 值调节至 7.3，并在 4 °C 下以 100,000 x g 超速离心溶液 2 小时。用 0.22 μm 无菌过滤器过滤上清液，并将溶液分装储存在 -80 °C
      谨慎:氢氧化钠溶液可引起化学灼伤，接触眼睛后可导致永久性失明。处理此化学品或其溶液时，请使用橡胶手套、安全服和护目镜。
3. 用生物素标记抗 CD3 抗体，以使用先前描述的方法产生单生物素化抗体分子。
   1. 制备 0.1 mg/mL 的生物素-PEO4-NHS 在二甲基亚砜 （DMSO） 中的溶液。将 3.7 μL 生物素-PEO4-NHS 溶液加入 1 mg 抗体中，溶于 0.5 mL 含有 100 mM 碳酸氢钠的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
   2. 在室温下将混合物孵育 2 小时。在 DMSO 中制备 10 mg/mL 的 Alexa Fluor 488 NHS 酯溶液。将 Alexa Fluor 488 NHS 酯溶液以 10 倍摩尔量添加到生物素-PEO4-NHS 标记的抗体中。
   3. 将混合物在室温下孵育 1 小时，并在常规磁力搅拌器上缓慢搅拌。使用尺寸排阻色谱分离未结合的染料。
   4. 通过测量抗体溶液在 280 nm 处的光密度 （A280） 来确定抗体浓度。在 577 nm 处测量标记抗体的光密度 （A577）。
   5. 使用以下公式确定染料与抗体的比例:
      
      注意: 在制造商的实验方案中查找其他详细信息。
4. 如前所述，在果蝇表达系统中表达重组可溶性细胞间粘附分子 1 （ICAM-1） 蛋白。
   1. 用 cDNA 编码将 ICAM-1 的胞外域克隆到果蝇表达载体 pMT/V5-His 中，并带有诱导型金属硫蛋白启动子，以产生在 C 末端附加有 His6 标签的重组蛋白。
   将
   2. S2 细胞与所得的 ICAM-1 共转染，其中包含质粒和遗传霉素 （G418） 表达载体。使用添加 10% 胎牛血清 （FCS） 和 0.5 mg/mL G418 的 Schneider 果蝇培养基选择稳定的转染子，持续 3 周。在无血清昆虫培养基中扩增细胞，并用 0.5 mM CuSO₄ 诱导蛋白质表达 3 天。
   如前所述
   3. ，将培养上清液浓缩 10 倍并通过切向流浓缩器对 PBS 进行透析。
   4. 将浓缩的培养上清液涂在含有共价固定的抗 ICAM-1 单克隆抗体的 Sepharose 的色谱柱上，并用 50 mM 甘氨酸缓冲液 （pH 3.0） 洗脱结合的 ICAM-1。立即用 pH 8.0 的 2 M Tris 缓冲液中和洗脱的 ICAM-1 蛋白。
   5. 用 PBS（pH 值为 8.0）透析洗脱的材料，并将透析的材料添加到含有 Ni-NTA（镍-氮基乙酸）琼脂糖的色谱柱中。用 200 mM 咪唑 （pH 8.0） 洗脱可溶性 ICAM-1。用 PBS 缓冲液 （pH 8.0） 透析洗脱的材料。
   6. 根据制造商的说明，用 Cyanine5 N-羟基琥珀酰亚胺 （Cy5 NHS） 酯标记纯化的 ICAM-1。
      注意:最佳最终染料与蛋白质比例为 1:1。
5. 通过木瓜蛋白酶消化从抗 CD107a 抗体中产生 Fab 片段，并如前所述通过离子交换色谱纯化 Fab 片段。根据制造商的说明，用 Alexa Fluor 568 NHS 酯标记 Fab 片段。

3. 玻璃支撑的平面脂质双层的形成

1. 通过将 140 mL 浓硫酸和 60 mL 30% 过氧化氢混合，制备新鲜的酸性食人鱼溶液。通过将流式载玻片的玻璃盖玻片浸泡在酸性食人鱼溶液中 30 分钟来清洗它们。用聚丙烯剪刀式镊子夹住玻璃盖玻片。
   谨慎: 食人鱼溶液是一种极强的氧化剂。请记住在处理溶液时始终佩戴安全眼镜或护目镜或全面罩以及厚橡胶手套。只能在通风橱下使用食人鱼溶液。避免在使用过程中随时加热、运输或摇晃它，因为它可能会爆炸。将食人鱼废物收集到一个带有含铅孔的玻璃瓶中。联系机构安全委员会，了解如何正确利用废物。
2. 用超纯水冲洗清洗过的盖玻片 7 次，依次转移到装有淡水的烧杯中。将湿的盖玻片放在一边，让剩余的水从干净的玻璃杯上滚落，留下干燥的玻璃杯。
   1. 或者，使用连接到真空泵的移液器吸头小心地从盖玻片上去除剩余的水滴。
3. 在无菌罩中，对各种脂质进行稀释，以产生用于制备双层的脂质体混合物。首先，混合 37 μL 的 DOPC 脂质体和 3 μL 的生物素-Cap-PE 脂质体。其次，混合 14 μL 的 DOPC 脂质体和 15 μL 的 DOGS-NTA 脂质体。然后，将 1 μL 第一种混合物添加到 29 μL 第二种混合物中，以制备最终的脂质体混合物。
4. 在无菌罩中，设置一个工作区，附近有干燥的盖玻片。将 2 μL 的最终脂质体混合物（参见步骤 3.3）精确地分装在自粘载玻片通道的中心。立即非常精确地将干净干燥的盖玻片与载玻片对齐，然后轻轻降低载玻片粘性一侧的盖玻片。
   1. 如果准备多个载玻片，请一次处理一张载玻片，因为脂质体混合物会迅速蒸发。将载玻片翻转过来，用聚丙烯剪刀式镊子的外环对盖玻片与载玻片的外围接触处施加轻柔的压力，确保载玻片与载玻片紧密相连，以防止渗漏><。 注意: 不要压迫载玻片的通道，以免破坏或破裂盖玻片。
   2. 再次将载玻片翻转过来，通过在组件的外部载玻片侧的双层周围用永久性标记绘制 4 个点，标记形成的双层的位置，该位置看起来像盖玻片和通道载玻片之间的液滴。
5. 在首次将液体注入通道之前，将通道的一个端口指定为入口端口，将另一个端口指定为出口，并在整个实验过程中保持此名称。
6. 为避免形成气泡，请将移液管吸头的末端直接插入通道的入口。用 50 μL 温热（至少室温）测定缓冲液缓慢填充载玻片的通道（缓冲液成分参见步骤 1.5）。
7. 制备 0.5 M 氯化镍 （II） 溶液。在 37 °C 的水浴中解冻 2 mL 等分的酪蛋白溶液 30 分钟，然后补充终浓度为 200 μM 的氯化镍溶液。
8. 首先在通道的入口处注入 100 μL 酪蛋白溶液，然后立即通过移液从载玻片的出口中取出 100 μL，以洗涤双层。将 100 μL 酪蛋白溶液注入每个通道的入口，并在室温下孵育载玻片 45 分钟，用相同的溶液封闭双层。
9. 解冻 Cy5-ICAM-1-His₆ 和链霉亲和素蛋白的等分试样。将蛋白质混合在检测缓冲液中，每种蛋白质的终浓度为 2 μg/mL。将溶液在 20,000 x g 和 4 °C 下离心 30 分钟以去除任何聚集体。
10. 通过移液从载玻片通道的出口处去除其余的封闭溶液。将 100 μL 含有 ICAM-1 和链霉亲和素的溶液注入入口。
11. 在室温下孵育载玻片 45 分钟。从出口去除任何多余的蛋白质溶液。首先在通道的入口处注入 100 μL 检测缓冲液，然后立即从出口中取出 100 μL，洗涤双层 2 次。
12. 用检测缓冲液稀释 Alexa-Fluor-488 标记的抗 CD3 抗体至终浓度为 2 μg/mL。将 100 μL 抗体溶液注入载玻片的入口，并在室温下孵育 45 分钟。从出口去除任何多余的蛋白质溶液。如步骤 3.11 所示，用 100 μL 测定缓冲液洗涤双层 2 次。

4. T 细胞与平面双层相互作用的成像

1. 预热共聚焦或全内反射荧光 （TIRF） 显微镜的载物台和物镜，直到温度平衡在 37 °C。在加热的载物台上设置带有双层的载玻片。根据墨水标记将载物台移动到适当的位置，并专注于利用 Cy 标记的 ICAM-1 分子荧光的双层。
   1. 共聚焦显微镜使用 61X 物镜，TIRF 显微镜使用 100X 物镜，并进行适当的滤光片设置。
2. 对于通过 TIRF 显微镜进行的颗粒释放成像，在将细胞注射到入口之前，将 Alexa-Fluor-568 标记的抗 CD107a 抗体 Fab 片段以终浓度为 4 μg/mL 添加到细胞悬液中。
   1. 重悬从 LN PB 或脐带血中分离的制备好的 CD4 ⁺ T 细胞，并将 50 μL 细胞悬液注射到包含双层的载玻片通道的入口中。
3. 选择所需的字段数，并在注射后 30 分钟内每 2 分钟记录每个字段的图像 1 次。
4. 利用共聚焦显微镜的明场、反射光和荧光通道（Alexa 488 和 Cy5）来获取图像。在 TIRF 显微镜上，将 TIRF 模式用于 Alexa-Fluor-488 和 Alexa-Fluor-568 荧光，使用宽场进行 Cy5 荧光以及明场成像。