一种用于研究T细胞与支撑性平面脂双层相互作用的体外技术

摘要

来源：Steblyanko, M.，等。外周血和淋巴组织来源的人原代T细胞突触界面的评估。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种 体外 研究人原代T细胞与支撑脂质双层（SLB）之间免疫突触形成的实验技术。T细胞表面蛋白与固定在SLB上的相应配体相互作用，形成免疫突触，随后杀伤性颗粒向突触方向移动，可通过荧光显微镜观察该过程。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 用于图像分析的CD4⁺ T细胞分离

1. 从收集的样本中解冻一份含有10⁷个冷冻外周血单个核细胞（PBMCs）或淋巴结单个核细胞（LNMCs）的1 mL等分试样。在无菌操作台中，将解冻后的细胞加入9 mL含青霉素/链霉素和谷氨酰胺的RPMI培养基中。
   1. 在4 °C条件下，以300 x g离心10分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于5 mL含10%胎牛血清（FBS）的RPMI完全培养基中。将细胞置于37 °C、CO₂培养箱中过夜孵育。
2. 次日，根据生产商说明书，使用市售试剂盒通过阴性免疫磁珠分选法纯化CD4⁺ T细胞。
3. 为测定新纯化的CD4⁺ T细胞数量，取5 µL细胞悬液与等体积的台盼蓝溶液混合。将细胞与台盼蓝的混合液加入血细胞计数板，计数计数板内5个区域中的活细胞数。
4. 取细胞计数的平均值，并计算原始细胞悬液中的细胞总数：细胞数/1 mL = 平均计数 × 2 × 10⁴。若分离得到的细胞总数过少，可不计数而直接使用。
5. 以300 x g离心10分钟，将细胞重悬于检测缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，137 mM NaCl，2 mM Na₂HPO₄，5 mM D-葡萄糖，5 mM KCl，1 mM MgCl₂，2 mM CaCl₂，以及1%人血清白蛋白）中，浓度为每50 µL含10⁵个细胞或更低，并将细胞置于4 °C保存（1–2小时），待实验使用。
6. 所有生物废弃物应按照相关机构指南进行处理。
7. 如需作为对照细胞群体，可从脐带血PBMC中制备活化的CD8⁺ T细胞：将10⁷个细胞置于5 mL完全培养基中，接种于T25培养瓶，瓶表面预先包被抗-CD3和抗-CD28抗体，浓度分别为10 µg/mL和1 µg/mL。
8. 次日，从培养瓶中收集活化的脐带血细胞，用新鲜完全培养基洗涤一次，并在重组IL-2（100 U/mL）存在下扩增培养2周。
9. 根据生产商说明书，使用市售试剂盒通过阴性免疫磁珠分选法纯化脐带血CD8⁺ T细胞。计数细胞，并按照步骤1.3–1.6中所述方法将培养基更换为检测缓冲液，用于LN和PB来源的CD8⁺ T细胞。

2. 平面脂双层制备所需的组分

1. 制备3种脂质体，具体方法如下：（a）0.4 mM DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱）脂质体，(b) 含有33 mol% DOGS-NTA（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[镍-氮川二乙酸]）的0.4 mM DOPC 脂质体sn甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]（铵盐）脂质，(c) 0.4 mM DOPC 脂质体，含 4 mol% 生物素-帽-PE（1,2-二油酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽状生物素)（钠盐）
2. 按先前所述方法制备5%的酪蛋白溶液。
   1. 将5 g酪蛋白粉末溶解于100 mL超纯水中，加入350 µL 10 M氢氧化钠。在室温下，根据可用的规模，用普通磁力搅拌器以低速搅拌2小时，然后在4 °C下继续搅拌过夜。调节pH至7.3，于4 °C下以100,000 × g超速离心2小时。用0.22 µm无菌滤膜过滤上清液，将溶液分装后于-80 °C保存。
      警告： 氢氧化钠溶液可导致化学灼伤，接触眼睛可能引起永久性失明。操作该化学品或其溶液时，应佩戴橡胶手套、防护服和护目用具。
3. 采用先前描述的方法，用生物素标记抗CD3抗体，以制备单生物素化抗体分子。
   1. 配制浓度为 0.1 mg/mL 的 Biotin-PEO4-NHS 二甲基亚砜（DMSO）溶液。取 3.7 µL 该 Biotin-PEO4-NHS 溶液，加入含 100 mM 碳酸氢钠的 0.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中的 1 mg 抗体中。
   2. 室温孵育混合物2小时。用DMSO配制10 mg/mL的Alexa Fluor 488 NHS酯溶液。将Alexa Fluor 488 NHS酯溶液以10倍摩尔过量加入至由Biotin-PEO4-NHS标记的抗体中。
   3. 在室温下，使用普通磁力搅拌器缓慢搅拌，孵育混合物1小时。通过尺寸排阻色谱法分离未结合的染料。
   4. 通过测量抗体溶液在 280 nm 处的光密度（A280）确定抗体浓度。在 577 nm 处测量标记抗体的光密度（A577）。
   5. 使用以下公式确定染料与抗体的比率：
      
      注意： 详见制造商提供的实验方案。
4. 表达一种重组可溶性细胞间黏附分子1（ICAM-1）蛋白 黑腹果蝇 表达系统如先前所述。
   1. 克隆编码 ICAM-1 胞外域的 cDNA 黑腹果蝇 带有可诱导的金属硫蛋白启动子的表达载体pMT/V5-His，用于表达在C末端带有His6标签的重组蛋白。
   2. 将含有 ICAM-1 的质粒与遗传霉素（G418）表达载体共同转染 S2 细胞。利用 Schneider's 培养基筛选稳定转染的细胞 果蝇 添加10%胎牛血清（FCS）和0.5 mg/mL G418的培养基中培养3周。在无血清昆虫培养基中扩增细胞，并用0.5 mM CuSO₄诱导蛋白表达₄ 3天。
   3. 将培养上清液浓缩10倍，并用PBS透析 通过 切向流浓缩器，如先前所述。
   4. 将浓缩的培养上清液加入含有共价固定化抗ICAM-1单克隆抗体的Sepharose柱，用50 mM甘氨酸缓冲液（pH 3.0）洗脱结合的ICAM-1。洗脱后的ICAM-1蛋白立即用2 M Tris缓冲液（pH 8.0）中和。
   5. 将洗脱物在 pH 8.0 的 PBS 中透析，然后将透析后的样品加入含 Ni-NTA（镍-次氮基乙酸）琼脂糖的层析柱中。用 200 mM 咪唑（pH 8.0）洗脱可溶性 ICAM-1。将洗脱物再次在 pH 8.0 的 PBS 缓冲液中透析。
   6. 根据制造商说明书，使用氰基5-N-羟基琥珀酰亚胺（Cy5 NHS）酯标记纯化的ICAM-1。
      注意： 最佳的最终染料与蛋白质比例为1:1。
5. 通过木瓜蛋白酶消化法从抗CD107a抗体中制备Fab片段，并按先前所述方法通过离子交换色谱纯化Fab片段。根据制造商说明书，使用Alexa Fluor 568 NHS酯对Fab片段进行标记。

3. 玻璃支撑平面脂双层的形成

1. 通过将140 mL浓硫酸与60 mL 30%过氧化氢混合，制备新鲜的酸性piranha溶液。将玻璃盖玻片浸入piranha酸溶液中30分钟，以清洗流动池所用的盖玻片。使用聚丙烯剪刀形镊子夹持玻璃盖玻片。
   注意：piranha溶液是一种极强的氧化剂。操作该溶液时，务必始终佩戴安全眼镜、护目镜或全面罩，并戴上厚橡胶手套。仅可在通风橱内操作piranha溶液。使用过程中切勿加热、搬运或摇动，以免发生爆炸。将废弃的piranha溶液收集至带有铅衬孔的玻璃瓶中。有关废液的正确处理方法，请联系机构安全委员会。
2. 将清洗后的盖玻片依次转移至盛有新鲜超纯水的烧杯中，重复冲洗7次。将湿润的盖玻片放置一旁，使残留的水珠从洁净的玻璃表面流下，留下干燥的玻璃表面。
   1. 或者，可将连接至真空泵的移液枪头小心地用于去除盖玻片上残留的水滴。
3. 在无菌操作台中，对多种脂质进行稀释，以制备用于形成双层膜的脂质体混合物。首先，将37 µL DOPC脂质体与3 µL Biotinyl-Cap-PE脂质体混合。其次，将14 µL DOPC脂质体与15 µL DOGS-NTA脂质体混合。第三，将第一种混合物取1 µL加入29 µL第二种混合物中，制得最终的脂质体混合物。
4. 在无菌操作台中，准备一个工作区，并将干燥的盖玻片置于附近。精确地将2 µL最终脂质体混合物（见步骤3.3）加至自粘式载玻片通道的中央。立即精确对齐干净且干燥的盖玻片与载玻片，并轻轻将盖玻片压向载玻片的粘性面，使其缓慢贴合。
   1. 若需制备多个载玻片，请逐个操作，因为脂质体混合物会迅速蒸发。将载玻片翻转，使用聚丙烯剪刀形镊子的外环轻轻按压盖玻片与载玻片的边缘接触处，确保盖玻片牢固粘附于载玻片，防止泄漏。
      注意：切勿按压载玻片的通道区域，以免导致盖玻片破裂或开裂。
   2. 再次翻转载玻片，并用永久性记号笔在组件外侧的载玻片表面围绕双层膜区域画四个点，标记所形成的双层膜位置（双层膜在盖玻片与通道载玻片之间呈液滴状）。
5. 在向通道中首次注入液体前，指定其中一个端口为进样口，另一个为出样口，并在整个实验过程中保持该设定不变。
6. 为避免产生气泡，将移液枪头末端直接插入通道的进样口。缓慢向载玻片的通道中加入50 µL温热（至少室温）的检测缓冲液（缓冲液成分见步骤1.5）。
7. 制备0.5 M氯化镍(II)溶液。将2 mL分装的酪蛋白溶液在37 °C水浴中解冻30分钟，并加入氯化镍溶液，使其终浓度为200 µM。
8. 首先通过进样口注入100 µL酪蛋白溶液，然后立即用移液器从载玻片的出样口移除100 µL液体，以清洗双层膜。通过向每个通道的进样口注入100 µL酪蛋白溶液，对双层膜进行封闭，并将载玻片在室温下孵育45分钟。
9. 解冻分装的Cy5-ICAM-1-His₆和链霉亲和素蛋白。将这两种蛋白在检测缓冲液中混合，终浓度均为2 µg/mL。在20,000 × g、4 °C条件下离心30分钟，以去除任何聚集体。
10. 用移液器从载玻片通道的出样口移除剩余的封闭液。将100 µL含ICAM-1和链霉亲和素的溶液注入进样口。
11. 将载玻片在室温下孵育45分钟。从出样口移除多余的蛋白溶液。通过先向通道进样口注入100 µL检测缓冲液，再立即从出样口移除100 µL液体的方式，清洗双层膜两次。
12. 用检测缓冲液将Alexa Fluor 488标记的抗CD3抗体稀释至终浓度2 µg/mL。向载玻片的进样口注入100 µL抗体溶液，并在室温下孵育45分钟。从出样口移除多余的蛋白溶液。按照步骤3.11的方法，用100 µL检测缓冲液清洗双层膜两次。

4. T细胞与平面双层膜相互作用的成像

1. 将共聚焦显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜的载物台和物镜预热，直至温度在 37 °C 达到平衡。将含有双层膜的载玻片置于加热载物台上。根据墨水标记移动载物台至适当位置，并利用 Cy 标记的 ICAM-1 分子的荧光对双层膜进行聚焦。
   1. 使用共聚焦显微镜的 61X 物镜，或 TIRF 显微镜的 100X 物镜，并设置适当的滤光片。
2. 进行 TIRF 显微镜下的颗粒释放成像时，在将细胞注入入口前，向细胞悬液中加入 Alexa-Fluor-568 标记的抗 CD107a 抗体 Fab 片段，终浓度为 4 µg/mL。
   1. 重悬从淋巴结、外周血或脐带血中分离得到的 CD4⁺ T 细胞，并将 50 µL 细胞悬液注入含有双层膜的载玻片通道入口。
3. 选择所需数量的视野，并在加样后 30 分钟内每 2 分钟对每个视野进行一次成像记录。
4. 利用共聚焦显微镜的明场、反射光及荧光通道（Alexa 488 和 Cy5）采集图像。在 TIRF 显微镜上，对 Alexa-Fluor-488 和 Alexa-Fluor-568 荧光采用 TIRF 模式，对 Cy5 荧光以及明场成像采用宽场模式。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人 CD4 T 细胞分离试剂盒	Miltenyl Biotec	130-096-533
人 CD8 T 细胞分离试剂盒	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
DOGS NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
人血清白蛋白	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
sticky-Slide 盖玻片	ibidi	10812
Bioptech FCS2 培养室	Bioptech	060319-2-03
抗 CD3 抗体	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 克隆，杂交瘤细胞可从 ATCC 获取
抗 CD28 抗体	Genetex	GTX14664	9.3 克隆
酪蛋白	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒（含标记蛋白纯化柱）	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 蛋白标记试剂盒（含标记蛋白纯化柱）	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS 酯	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His A, B, C 果蝇表达载体	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 果蝇表达载体（用于阳性筛选）	ATCC	37409
无血清果蝇培养基 Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
杂交瘤 YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	该杂交瘤分泌抗 ICAM-1 的抗体。
溴化氰活化的 Sepharose 4B	Sigma-Aldrich	C9142	用于制备共价结合抗 ICAM 抗体的 Sepharose。
MasterFlex 切向流浓缩器	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	用于含 ICAM-1 上清液的浓缩及透析
Centramate 实验室切向流系统	Pall Laboratory	FS002K10 OS010T12 FS005K10	用于含 ICAM-1 上清液的浓缩及透析
Ni-NTA 琼脂糖	QIAGEN	30210
透析袋	Spectra/Por	131384
木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶）	Sigma	P3125
小鼠抗人 CD107a 抗体	BD Biosciences	555798	克隆 H4A3
Ansell Natural Blue 手套	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene 聚丙烯剪式镊子	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
链霉亲和素	ProZyme	SA10
共聚焦显微镜	Nikon		Nikon TiE 倒置显微镜，配备 PFS 以实现长期成像稳定性控制，60 倍油镜，4 根激光器激发波长分别为 405、458、488、514、561 和 640 nm，2 个 GaAsP 检测器和 2 个高灵敏度 PMT，DIC 透射光，可编程 X,Y,Z 载物台用于多点成像和大范围图像拼接，延时成像功能，Tokai-Hit 温控及 CO2 控制培养室用于活细胞成像，以及防震隔离台
TIRF 显微镜	Andor		Andor Revolution XD 系统，配备 Nikon TIRF-E 照明器，激光器激发波长为 405、488、561 和 640 nm，DIC 透射光，Yokogawa CSU-X1 旋转盘共聚焦头，100/1.49 NA 物镜，Andor iXon X3 EM-CCD 相机，物镜加热器，以及配备完美焦距系统（PFS）的压电马达化载物台