免疫调节药剂对树突状细胞与CD4+ T细胞相互作用的影响

摘要

来源：Wei, H., 等. 小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征. J. Vis. Exp. (135), (2018)。

本视频演示了一种使用免疫调节药理学试剂将树突状细胞（DCs）转化为耐受性树突状细胞（TolDCs）的方法。通过评估TolDCs对CD4+ T细胞的免疫抑制作用，可验证该转化效果。

方案

1. 评估耐受性树突状细胞（TolDCs）的功能 体外 和 体内

1. T细胞同基因增殖实验
   1. 通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌，并在II级生物安全柜中按照适当的安全规程进行实验。
   2. 使用500 ml PBS配制含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的MACS缓冲液。通过0.2 µm滤器过滤以灭菌。
      注意：后续实验过程中请将缓冲液置于冰上。
   3. 为获取CD4+ T细胞，使用CO₂舱对8-10周龄的OT-II T细胞受体（TCR）转基因小鼠实施安乐死。将小鼠置于解剖板上，并用70%乙醇冲洗。使用手术剪和镊子从腹部左侧分离脾脏。
   4. 将脾脏置于含2 ml PBS的6 cm培养皿中，用3 ml注射器推杆的末端通过40 μm细胞筛网研磨脾脏组织。
   5. 收集细胞悬液，以300 x g离心5分钟。
   6. 将细胞沉淀重悬于400 μl MACS缓冲液中。
   7. 在4°C下加入100 μl CD4+ T细胞生物素标记抗体混合物，孵育5分钟。
      注意：该抗体混合物结合除CD4+ T细胞以外的其他细胞类型，例如CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、抗MHC II类分子、Ter-119以及TCRγ/δ。
   8. 在4°C下加入300 μl MACS缓冲液和200 μl抗生物素磁珠（材料表），孵育10分钟。
   9. 将由铁磁性微球组成的分选柱（材料表）与预分离滤器一同置于磁场中，并用3 ml MACS缓冲液冲洗。
   10. 向细胞中加入9 ml MACS缓冲液，以300 x g离心5分钟。
   11. 将细胞沉淀重悬于3 ml MACS缓冲液中，加载至分选柱上。收集流穿液，其中含有CD4+ T细胞。
   12. 用另外3 ml MACS缓冲液洗涤分选柱，并收集流穿液。
   13. 为获取脾脏总树突状细胞（pan DCs），使用CO₂舱对8-10周龄的C57BL/6小鼠实施安乐死。将小鼠置于解剖板上，并用70%乙醇冲洗。使用手术剪和镊子从腹部左侧分离脾脏。将脾脏放入含2 ml胶原酶D溶液（2 mg/ml胶原酶D溶于含钙和镁的HBSS）的6 cm培养皿中。
   14. 使用1 ml注射器和25G针头向脾脏内注射1 ml胶原酶D溶液，重复两次。用小剪刀将脾脏剪成小块。
   15. 室温下振荡并孵育25分钟。
   16. 室温下加入500 μl 0.5 M EDTA，孵育5分钟。
       注意：步骤1.1.13至1.1.14对于提高DC产量至关重要。
   17. 现在使用3 ml注射器推杆的末端通过40 μm细胞筛网研磨脾脏匀浆，收集细胞悬液并以300 x g离心5分钟。
   18. 在4°C下将细胞沉淀重悬于350 μl MACS缓冲液、50 μl FcR阻断试剂和100 μl总树突状细胞生物素标记抗体混合物中，孵育10分钟。
       注意：该抗体混合物针对DC不表达的抗原。
   19. 加入9 ml MACS缓冲液洗涤细胞，以300 x g离心5分钟。
   20. 将细胞沉淀重悬于800 μl MACS缓冲液中，在4°C下加入200 μl抗生物素磁珠，孵育10分钟。
   21. 重复步骤1.1.9至1.1.11以收集DCs。
   22. 用另外3 ml MACS缓冲液洗涤分选柱两次，并收集流穿液。
   23. 将2 x 10⁵ 个DCs/ml在37°C下与或不与100-400 nM CDDO-DFPA共同孵育1小时。同时，将CD4+ T细胞（1 x 10⁷/ml）在37°C下用1 μM CFSE标记15分钟，用PBS洗涤后调整体积，使最终浓度为2 x 10⁶ 个T细胞/ml。
   24. 接下来，在96孔板中，将100 μl经处理的树突状细胞与等体积的CFSE标记CD4+ T细胞共培养（均来自上述步骤），以获得1:10的比例。每孔加入100 ng/mL卵清蛋白（OVA）肽323-329，孵育2-3天后通过流式细胞术检测T细胞的CFSE荧光强度。
       注意：树突状细胞与T细胞的细胞数量及比例已在我们先前的研究中优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	in house synthesis	细胞培养
小鼠 GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	骨髓来源树突状细胞分化
全树突状细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T细胞增殖实验
全树突状细胞生物素标记抗体混合液	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T细胞增殖实验
CD4+ T细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	T细胞增殖实验
CFSE	BioLegend	423801	T细胞增殖实验
FcR阻断试剂	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T细胞增殖实验
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T细胞增殖实验
1 ml 注射器	BD Biosciences	309626	T细胞增殖实验
BSA	Sigma Aldrich Inc	A2058	T细胞增殖实验
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020	T细胞增殖实验
LS 柱	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	T细胞增殖实验
分离前过滤器	Miltenyi Biotec Inc	130-095-823	T细胞增殖实验
胶原酶 D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	T细胞增殖实验
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	T细胞增殖实验
卵清蛋白 (OVA) 肽段 323–329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	T细胞增殖实验