一种体外可视化肥大细胞分泌颗粒胞吐作用的技术

摘要

来源：Klein, O.，等。利用FITC-葡聚糖成像作为调控性胞吐作用的报告分子 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种用于可视化肥大细胞中胞吐作用的技术。将细胞与FITC-葡聚糖（一种荧光报告分子）共同孵育，该分子会被细胞摄取并进入分泌颗粒（SGs）内，由于分泌颗粒内的酸性pH环境会淬灭其荧光。当刺激引发分泌颗粒发生胞吐时，外界中性pH的培养基使得报告分子在融合后的分泌颗粒内恢复荧光，可通过荧光显微镜观察到这一现象。

方案

1. 准备工作

1. 制备 RBL（RBL-2H3 肥大细胞系）培养基
   1. 将 500 mL 低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）与 56 mL 胎牛血清（FBS）、5.5 mL 青霉素-链霉素-制霉菌素溶液、5.5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液混合。最终得到含 10% FBS、100 µg/mL 链霉素、100 单位/mL 青霉素、12 单位/mL 制霉菌素和 2 mM L-谷氨酰胺的低糖 DMEM 培养基。
   2. 使用孔径为 0.22 µm 的真空滤器过滤培养基，并于 4 °C 保存。
2. RBL 细胞的维持
   1. 在 10 cm 培养皿中将 RBL 细胞培养至最大 90% 汇合度。若细胞状态良好，应呈纺锤形，偶见突起。
   2. 进行细胞传代时，吸除培养基，加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液 B，于 37 °C、5% CO₂ 的湿化环境中孵育 5–10 分钟，使细胞脱离培养皿。
   3. 细胞脱落后，用移液器加入 2 mL 培养基以中和胰蛋白酶，并按 1:2 至 1:10 的比例传代细胞。
3. 制备 20 倍浓度 Tyrode 缓冲液
   1. 在双蒸水（DDW）中配制 54 mM KCl、20 mM MgCl₂、2.74 M NaCl 和 8 mM NaH₂PO₄ 的 20 倍浓度储备液。充分混匀后于 4 °C 保存。

2. 用于活细胞显微镜观察的RBL细胞培养

1. 制备 FITC-葡聚糖溶液。
   1. 每 1 mL 培养基中加入 1 mg 荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖粉末（150 K）混合溶解（参见步骤 1.1.1）。若需填满整个腔室盖玻片，准备 3 mL 溶液。
   2. 使用孔径为 0.22 µm 的醋酸纤维素注射器滤器过滤已溶解的 FITC-葡聚糖溶液。
   3. 加入小鼠免疫球蛋白 E（IgE），使其终浓度为 1 µg/mL。
2. 用于成像的 RBL 细胞接种
   1. 成像前一天，吸除培养皿中的培养基，并加入 2 mL 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 B。在 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中孵育 5 - 10 分钟。待细胞脱落后，加入 2 mL 培养基以中和胰蛋白酶活性。
   2. 使用血细胞计数板对 RBL 细胞进行计数，并根据需要加入培养基调整体积，使细胞浓度达到 7.5 × 10⁵/mL。
   3. 将 10 µL 细胞悬液加入已预先装满新鲜含 FITC-葡聚糖的培养基的腔室盖玻片中（每个腔室接种 7.5 × 10³ 个细胞）。
   4. 将 RBL 细胞在 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养过夜。细胞应保持亚汇合状态，以确保细胞彼此分离，便于在显微镜下清晰识别单个细胞。
3. RBL 细胞转染——可选步骤。
   1. 若需结合其他荧光标记蛋白对胞吐事件进行成像，请参见 Azouz et al. 中关于 RBL 细胞的转染方案。

3. 胞吐作用的活细胞显微镜观察

1. 溶液的配制：
   1. 通过将储备液以1:20的比例用去离子水（DDW）稀释，配制终浓度的Tyrode缓冲液，并添加20 mM Hepes（pH 7）、1.8 mM CaCl₂、1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）和5.6 mM 葡萄糖。
   2. 在Tyrode缓冲液中新鲜配制20倍浓度的促分泌试剂[以本实验为例，使用浓度为1 µg/mL的二硝基苯酚偶联人血清白蛋白（DNP-HAS（Ag）），对应1倍工作浓度为50 ng/mL]。
   3. 将粉末溶于Tyrode缓冲液中，配制400 mM 氯化铵溶液。
2. 细胞的准备。
   1. 用移液器吸去腔室盖玻片中的培养基，并用300 µL预热至37 °C的Tyrode缓冲液冲洗腔室3次。最后，向腔室中补充300 µL预热至37 °C的Tyrode缓冲液。
   2. 将腔室盖玻片放入显微镜的培养箱腔室内。确保腔室稳定。
3. 显微镜的设置
   1. 为选择待追踪的兴趣区域，打开荧光光源（传统上使用汞灯），并选择合适的荧光滤光片（观察FITC-葡聚糖时应选择绿色荧光染料对应的滤光片）。当兴趣区域处于焦平面且位于视野中央后，关闭光源以避免光漂白和光毒性。
      ​注意：部分细胞内摄入的FITC-葡聚糖可能保留荧光信号。这是因为FITC-葡聚糖也可能被分选至非溶酶体区室，如内体中。
   2. 开启适合FITC激发的照明光源。若使用激光显微镜，则打开488 nm激光器。发射光应收集在500 - 550 nm范围内（FITC的发射峰位于510 - 520 nm）。
   3. 使用共聚焦显微镜时，将针孔开至最大。这有助于降低激光功率，避免光漂白和光毒性，同时确保能够捕捉到细胞各个焦平面上的胞吐事件。
   4. 校准图像采集之间的时间间隔。
      1. 不同细胞的调节性胞吐动力学可能存在差异。针对复合胞吐的特异性成像，建议时间间隔至少为5秒。但通常而言，为实现快速成像，应确保单帧图像的采集时间尽可能短。
      2. 使用激光扫描共聚焦显微镜时，设置扫描方向为双向扫描，不启用平均扫描，分辨率设为512 x 512（推荐设置；后两项设置也有助于最小化光漂白和光毒性）。
4. 胞吐过程的成像。
   1. 根据细胞类型或促分泌剂的不同，对细胞进行指定时长的成像。在IgE/Ag激活的RBL细胞中，大多数胞吐事件发生在激活后15 - 20分钟内。
   2. 为激活细胞，向腔室中加入16 µL的20倍浓度促分泌剂溶液。
5. 确认细胞内FITC-葡聚糖的存在。
   1. 为确认FITC-葡聚糖在分泌颗粒（SGs）中的存在及定位，轻轻向腔室中加入16 µL氯化铵溶液（注意不要移动腔室，以免失焦），最终浓度为20 mM。这将引起分泌颗粒的碱化，从而解除FITC荧光的淬灭，该过程将在数秒内发生。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 低糖培养基	Biological Inductries	01-050-1A
胎牛血清	Gibco	12657
青霉素-链霉素-制霉菌素溶液	Biological Inductries	03-032-1B
L-谷氨酰胺 200 mM 溶液	Biological Inductries	03-020-1A
FITC 标记葡聚糖 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
胰蛋白酶/EDTA 溶液 B	Biological Inductries	03-052-1A	使用前于 37 °C 水浴中预热
0.22 µm 孔径顶部真空滤器	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
醋酸纤维素注射器滤器，0.22 µm 孔径	Sartorius	16534K
带腔室盖玻片	Thermo scientific	155411
Corning 组织培养处理培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430167
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503
抗-DNP 单克隆 IgE 抗体	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA（抗原）	Sigma-Aldrich	A6661	避免直接光照
HEPES 缓冲液 1 M，pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
葡萄糖	BDH Laboratories	284515V
氯化铵	MERK	1145
PIPES 二钾盐	Sigma-Aldrich	108321-27-3
醋酸钙水合物	Sigma-Aldrich	114460-21-8
四水合醋酸镁	Sigma-Aldrich	M5661
谷氨酸钾（L-谷氨酸钾盐一水合物）	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
电穿孔仪	BTX	ECM830
共聚焦显微镜，Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	用于图3。配备电子温控
气流培养箱
共聚焦显微镜，Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	用于图2。配备 GaAsP 检测器和电子温控
气流培养箱
共聚焦显微镜，Leica	Leica	SP5	用于图1。配备 Leica HyD 检测器和顶置式培养箱（okolab）
RBL-2H3 细胞			RBL-2H3 细胞由 Reuben P. Siraganian 实验室构建。参见参考文献67