使用 Calcium-Flux 测定法用抗原脂质体监测 B 细胞活化

摘要

来源:Bednar， K. J. et al.， 用于生成疾病特异性抗体的抗原脂质体。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频展示了通过利用抗原脂质体评估 B 细胞活化。使用流式细胞术区分用钙敏感的 Indo-1 染料处理的 B 细胞，并分析它们的紫色与蓝色荧光比值。当细胞遇到抗原脂质体时，它通过钙内流触发 B 细胞活化，随着时间的推移逐渐增强紫色与蓝色荧光信号的比率。

方案

1. 蛋白质抗原与聚乙二醇化脂质的偶联

1. 将 3 g 分离范围为 1,500–30,000 道尔顿 （Da） 的交联葡聚糖凝胶珠添加到 250 mL 真空瓶中。加入 60 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），并用磁力搅拌棒不断搅拌。密封烧瓶并将其连接到真空中，以在搅拌板上开始脱气至少 1 小时。
2. 在关闭周转塞的 1.0 cm x 30 cm 玻璃色谱柱中，向色谱柱中加入 PBS 进行洗涤。打开周转塞并排空色谱柱。洗涤后，将脱气珠浆液添加到色谱柱中。不断添加浆液，直到柱填充至约 24 cm 的微珠高度。
3. 一旦色谱柱在填充珠子上方有大约 4-5 cm 的 PBS"头"，请准备好以下步骤。
   1. 通过测量一根足够长的管子以到达塔顶部上方 1-2 英尺的架子来创建一个重力流虹吸管，并创建一个从塔底部附近下降并返回塔顶部的回路。在管路的一端添加一个翻转塞，使管路的一侧保持打开状态。将开口管端放入 500 mL PBS 瓶中，并将其放在色谱柱上方的架子上。
   2. 取带有翻转止动器的一端，并连接 10 mL 注射器。打开管路上的周转截止阀，将 PBS 吸入管路。一旦 PBS 到达管道的四分之三，迅速取出注射器并将周转塞添加到色谱柱顶部 — 液体应该流到色谱柱上。
      注意:留在柱顶部的 PBS "头部"量应在 1 到 3 cm 之间。清洗色谱柱的最小量为 3 倍柱体积。
4. 根据其分子量 （MW） 确定与脂质连接的蛋白质（摩尔）的量><。 注:山羊抗小鼠免疫球蛋白的 Fab 片段 IgM（本身是 IgG）在这里用作 B 细胞多克隆刺激的通用替代抗原。因此，山羊 IgG 的 Fab 片段的分子量约为 48 千道尔顿 （kDa），市售总量为 1.3 毫克。因此，要连接的蛋白质量为 27.1 μmol。
5. 确定目标蛋白质的消光系数。如果未知，则使用分光光度计测量 280 nm 处的蛋白质吸光度，并将 A₂₈₀ 值除以步骤 1.4.
   中计算的摩尔数 注:山羊 IgG 的 Fab 在 280 nm 处的消光系数为 64,600 M ^-1 。
6. 为确保去除痕量的含胺缓冲液，请在步骤 1.1-1.3 中创建的色谱柱上对蛋白质进行脱盐，并将蛋白质组分收集到 1.5 mL 微量离心管中（每组分 ~500 μL）。
   1. 关闭连接到塔顶部的周转截止阀，然后拆下塔顶部。如果尚未打开，请打开色谱柱底部的周转截止阀，并等待 PBS 的"头部"碰到珠子的顶部。
   2. 使用玻璃巴斯德移液管将目标蛋白质缓慢添加到珠子的顶部，小心地尽量减少对珠子顶部的干扰。
   3. 一旦蛋白质溶液的"头部"到达珠子的顶部，通过巴斯德移液管轻轻加入 1 mL PBS。重复 3 次。加入 PBS 以产生 4-5 cm 的头部，然后重复步骤 1.3 以洗涤色谱柱><。 注意:如果确定不存在含胺缓冲液，则可以跳过此步骤。
7. 通过测量 A280 值来确定含有蛋白质的馏分，并合并获得约 90% 蛋白质回收率的馏分。
   注:这通常将蛋白质稀释 1.5-2 倍。混合后测定蛋白质浓度。如有必要，在此步骤中使用离心浓缩器浓缩蛋白质。
8. 向蛋白质中加入 2.5 摩尔当量的异双功能交联剂。
   1. 首先，称取大约 5 mg 琥珀酰亚胺 3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯 （SPDP， MW = 314 g/mol） 放入微量离心管中。为了确定溶解 SPDP 的体积，将摩尔蛋白浓度乘以 250 倍以生成 100 倍溶液，该溶液将在反应中产生 2.5 摩尔过量。
      注:例如，如果蛋白质浓度为 50 μM，则需要 12.5 mM 的 SPDP 溶液。对于 5 mg 的 SPDP，这相当于 1.27 mL 的二甲基亚砜 （DMSO）。
9. 以 1:100 的稀释度将 SPDP 添加到目标蛋白中。将反应物放在室温 （RT） 下的振荡振荡器上约 1 小时。
10. 为了去除过量的 SPDP 并保护内源性二硫键，在随后的还原步骤中，在蛋白质中，在 pH 值为 5.5 的 100 mM 乙酸钠 （NaOAc） 中平衡并洗涤步骤 1.1-1.3 中创建的色谱柱，或创建仅用于该缓冲液的相同色谱柱。
11. 与 SPDP 孵育 1 小时后，在用 100 mM NaOAc 平衡的柱上对蛋白质进行脱盐。以与步骤 1.6 相同的方式执行此步骤，除了使用 100 mM NaOAc （pH 5.5） 作为洗脱液。收集馏分，测定 A₂₈₀，并合并顶部馏分。在 PBS 中洗涤色谱柱。
12. 在双蒸水 （ddH₂O） 中制备 2.5 M DTT （MW = 154 g/mol） 的溶液。将 25 mM DTT 添加到混合的蛋白质级分中 5-10 分钟。
13. 测量蛋白质的 A₂₈₀ 并将其除以消光系数。另外，确定 A₃₄₃。根据蛋白质 （A₂₈₀） 和接头 （A₃₄₃） 的摩尔浓度计算连接比。
    注意:如果使用 nanodrop 分光光度计，请关闭 A340 自动校准。A₃₄₃ 测量值表示吡啶 2-硫酮基团（消光系数 = 7550 ^M-1）的吸光度，该基团被 DTT 从 SPDP 交联剂中去除。当对多种蛋白质进行 2.5 摩尔过量的 SDPD 反应时，通常可以达到 1.2-1.5 的接头:蛋白质比。
14. 如上所述，在用 PBS 洗涤的色谱柱上运行合并的级分。收集馏分，测定 A₂₈₀ 并汇集顶部馏分。合并级分后，通过 A 280 测定蛋白质浓度。
15. 制备DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000）-马来酰亚胺。这将以 10:1 的摩尔比添加到蛋白质中。制备 100x DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺储备液以达到所需浓度。
    1. 例如，如果步骤 1.14 后蛋白质浓度为 10 μM，则制备 10 mM 的 DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺储备液。仔细称取 DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺 （MW = 3000 g/mol） 并加入适量的 DMSO。多轮温和的涡旋和超声处理可能会使其完全溶解。
16. 确定步骤 1.14 中级分的总体积，并将溶液小心转移到小 （10-25 mL） 圆底培养瓶 （RBF） 中。向蛋白质中加入适量的 100x DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺，以达到 1x、10 倍摩尔过量的最终浓度。轻轻旋转溶液以确保 DMSO 完全分散。
在
17. 密封的 RBF 中，在氮气下运行反应过夜。使用橡胶隔膜并将其放入通风橱中。
    1. 用 20 G 针头刺穿隔膜，针头连接到连接到真空管的管道末端的 3 mL 注射器，然后打开真空 3-5 秒，以去除大气。
    2. 用氮气代替大气。将连接到 3 mL 注射器的球囊中，用氮气切成两半，然后连接 20 G 针头。刺穿隔膜，用氮气填充圆底烧瓶内的大气。重复去除大气并再次用氮气替换，并将氮气球连接过夜。
18. 在 1.0 cm x 50 cm 玻璃色谱柱中制备单独的交联葡聚糖凝胶珠柱，其分馏范围为 4,000–150,000 Da（根据步骤 1.1-1.3）。
19. 第二天，从步骤 1.17 中制备的圆底烧瓶中取出蛋白质，并在交联葡聚糖凝胶珠柱（来自步骤 1.18）上运行（遵循步骤 1.6 中使用的方法）。
    注:上样到色谱柱上的总量应不超过 2 mL。如果使用了更大的反应，则分成两个，在单独的色谱柱上运行或在更大直径的色谱柱上运行。
    1. 收集级分，测定 A₂₈₀，汇集顶部组分，并确定蛋白质浓度。脂质的存在不会影响测量。
20. 将脂质连接蛋白的最终合并级分储存在 4 °C 直至准备好使用。

2. 脂质体制备

1. 称出脂质:DSPE-PEG（2000）（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000，MW = 2805.5 g / mol;胆固醇（3b-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾-3b-醇），MW = 386.7 g/mol;和 DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱），MW = 790.1 g/mol。在氯仿中制备 5 mg/mL 的 DSPC 溶液、4 mg/mL 胆固醇溶液和 2 mg/mL 的 DSPE-PEG（2000） 溶液。
2. 确保脂质体中脂质的摩尔比为:57% DSPC、38% 胆固醇和 5% DSPE-PEG（2000），如表 1.
   所示 注意:控制脂质体上的抗原量很重要，通常在 0.01-0.1% 之间。在表 1 中，使用了 0.1% 与 PEG 化脂质相连的山羊抗小鼠 IgM Fab 片段。重要的是要考虑到在步骤 1.15 中添加到蛋白质中的 DSPE-PEG（2000）-马来酰亚胺的 10 倍摩尔过量，以确保聚乙二醇化脂质的总量不超过 5%。
3. 在制备用于挤出的脂质时，请考虑最终脂质量 （μmol）。参见表 1，了解计算在 1.25 μM 总脂质浓度下产生脂质体的摩尔脂质浓度的示例。
4. 计算出要添加在一起的每种脂质的正确量后，将所有脂质混合到 12 mL 硼硅酸盐玻璃试管中。
5. 小心吹掉氯仿。
   1. 使用管道和步骤 1.17.1 中准备的带针头的 3 mL 注射器，用氮气小心地吹掉管中的氯仿。轻轻地将氮气流吹到溶液上，同时用另一只手旋转试管。小心避免飞溅或导致液体沿着管子的侧面流淌，因为在下一步中可能更难将其溶解。
6. 向每个试管中加入 100 μL DMSO，并将该溶液冻干过夜。用非静电实验室湿巾盖住管子的顶部，用橡皮筋固定，并在 -80 °C 下冷冻。

3. 脂质体挤出

1. 将 1 mL 含有脂质连接蛋白的 PBS 添加到含有脂质的 12 mL 试管中。在超声处理水浴中对溶液进行约 30 秒至 1 分钟的超声处理。每轮之间休息 5 分钟或更长时间，重复 3-4 次。
2. 按照制造商的指示准备挤出机。
   1. 将过滤支架添加到内膜支架上，并在石蜡膜上滴几滴（每滴 10 μL）PBS。使用镊子抓住过滤器支架的边缘，将其浸入 10 μL 液滴中。
   2. 将过滤器放在 O 形圈内。对双方都执行此作。使用镊子在 10 μL 液滴的边缘浸入 0.8 μm 过滤器，并在 O 形圈的外部涂上 PBS。将 0.8 μm 过滤器轻轻放在 O 形圈上，使过滤器不会悬垂在内部膜支架上。
3. 将挤出机加热块放在热板上以预热挤出机。将加热板调低，让挤出机加热块达到所需温度。为避免蛋白质聚集的潜在问题，请勿将模块加热到 37 °C 以上。
4. 将超声处理的样品装入放置在挤出机中的一个挤出注射器中。将挤出机注射器放入挤出机的另一端。确保空注射器柱塞设置为零。当脂质通过聚碳酸酯 0.8 μm 膜挤出时，空注射器将填充。尽量避免气泡通过膜来回流通。
5. 将完全组装好的挤出机放入加热块中。轻轻地将装满脂质的注射器的柱塞推到空注射器上。根据脂质浓度，这将很难通过。重复 20 次。
6. 从加热块中取出完全组装好的挤出机。从挤出机中慢慢取出装满的注射器，确保收集取出时可能泄漏的任何脂质。将脂质体放入干净的小瓶中。使用聚碳酸酯 0.2 μm 和 0.1 μm 膜重复步骤 3.4-3.6。
7. 创建一个 0.7 x 50 cm² 交联琼脂糖珠柱，分离范围为 0.7-10 兆道尔顿 （MDa），在 PBS 中平衡。添加脂质体并按照步骤 1.6 运行。含有脂质体的馏分在 250–400 nm 范围内的光透射率会降低。
8. 将脂质体储存在 4 °C 下，不要冻结。

4. 钙通量监测抗原脂质体对 B 细胞的激活

1. 根据机构标准作程序，通过二氧化碳 （CO₂） 或异氟醚过量对小鼠实施安乐死。通过颈椎脱位确认小鼠的安乐死。
2. 使用 70% 乙醇对手术器械和小鼠尸体进行消毒。使用 10 厘米长、尖端 0.8 毫米的弯曲虹膜镊子将覆盖胸腔的皮肤与胸腔分开。使用 10 厘米长的直解剖剪刀做一个双侧切口的远端切口。
3. 使用弯曲的虹膜镊子和解剖剪刀从腹腔中取出脾脏。去除脾脏周围的脂肪组织，然后将其放入装有 15 mL 聚苯乙烯锥形管中RPMI1640培养基中，该培养基含有 1% 胎牛血清 （FCS） 和青霉素-链霉素。
4. 通过安装在 50 mL 锥形管上的 40 μm 细胞过滤器转移脾脏和培养基。使用 3 mL 注射器柱塞的橡胶端，轻轻挤压脾脏。用培养基洗涤 40 μm 细胞过滤器。重复此过程，直到 40 μm 细胞过滤器中只剩下脂肪组织。用 3-5 mL 培养基冲洗筛子以提高细胞回收率。
5. 在 RT 下以 300 x g 离心细胞匀浆 5 分钟。离心后，弃去上清液，向沉淀中加入 10 mL 1x RBC 裂解缓冲液。上下移液，在 RT 下放置 2-3 分钟，然后在 RT 下以 300 x g 离心 5 分钟。
6. 弃去上清液，将去除红细胞的脾细胞重悬于 10 mL 培养基中。使用血球计数器或其他细胞计数设备确定总细胞数。如上所述通过离心沉淀细胞。
   注:脾细胞 Indo-1 上样所需的理想最终浓度为 10–20 x 10⁶ 个细胞/mL，但可以使用较低浓度的细胞。
7. 在钙通量加载缓冲液（Roswell Park Memorial Institute，RPMI1640含有 1% FCS、10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES）、1 mM 氯化镁 （MgCl₂）、1 mM 乙二醇-双（β-氨基乙基醚）-N、N、N'、N'-四乙酸 （EGTA） 和 5% 青霉素-链霉素的培养基）中以 15 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬脾细胞。从 1 mM DMSO 储备液中加入 1.5 μM Indo-1，并将试管倒置数次以混合。避光，并将细胞在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
8. 孵育 30 分钟后，加入 5 倍量的 Calcium Flux 上样缓冲液。在 RT 下以 300 x g 离心 7 分钟。
9. 对于B细胞的门控，在0.5 mL上样缓冲液中，在4°C下用1:200抗小鼠CD5-PE和抗小鼠1:200 B220-PE/Cy7对细胞进行染色20分钟，避光。
10. 在钙通量上样缓冲液中洗涤脾细胞，并在室温下以 300 x g 离心 7 分钟。在钙通量电泳缓冲液（含 1% FCS、1 mM MgCl₂ 和 1 mM 氯化钙 （CaCl₂） 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS））中以 10–20 x 10⁶ 个细胞/mL 的比例重悬细胞。储存在冰上，避光，直到准备好在流式细胞仪上运行。
11. 使用未染色和单染色对照设置流式细胞术以进行补偿。
    1. 运行染色的细胞以适当设置门（参见图 1A）。设置 Indo-1（紫色）与 Indo-1（蓝色）图，调整 Indo-1 通道中的电压，使细胞染色以 45-60° 的斜率最大化，以最大化 Indo-1 紫色的信号:噪声比:B 细胞刺激后蓝色比值的变化><。 注意:确保电压不要太高，以便很大一部分电池 （>5%） 靠在图的顶部。
    2. 创建一个对角线门，封装图的左上角（紫色 ⁺ 蓝色 ^- ），这样在没有刺激的情况下，<10% 的细胞在门中，理想情况下，刺激后应增加到 >75%。
12. 将 0.5 mL 细胞加入带盖的 5 mL 圆底聚苯乙烯管（荧光激活细胞分选 （FACS） 管）中，并在水浴中将细胞加热至 37 °C 3-5 分钟。将 FACS 管放入连接到再循环水浴的 37 °C 水套室中。
    1. 在流式细胞仪的水套中运行试管，然后以大约 5,000–10,000 个事件/秒的速度开始采集，不存储数据。一旦细胞稳定（15-30 秒），开始数据采集并收集数据至少 10 秒以建立背景。
    2. 在 10 个鼻涕标记处，从流式细胞仪中快速取出试管，添加刺激（2-20 μL 中 5-50 μM 抗原脂质体），脉冲涡旋，然后将 FACS 试管放回流式细胞仪上。在此期间保持数据采集和存储，并收集数据 3-5 分钟。
13. 在动力学功能下的适当分析软件中分析数据。

表 1:制备 1.25 μM 总脂质浓度脂质体的计算结果。山羊抗小鼠 IgM F（ab） 片段脂质体的计算表示例。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 分子量 790 元 387 元 2900 元 3000 元 48000 元 DSPC 胆固醇 PEG-DSPE 过量的 PEG-DSPE aIgM-PEG-DSPE 抗体 总 摩尔比 57 元 38 元 3.9 1 0,1 100.00 元 质量 （mg） 0,56 0,18 0,14% 0,04 0,06 0,98% MMOL 0,71 0,47 0,05 0,01 0.00 元 1,25% 毫升 112.50 元 45,93 70,64 元 0.00 元 525.97 元 755.03 浓度 （mg/mL） DSPC 5 胆固醇 4 PEG-DSPE 阿拉伯数字 aIgM-PEG-DSPE 抗体 0,114

结果

图 1:代表性的门控策略、钙通量结果和分析。（A） 通过以下设门策略分析细胞:活淋巴细胞 （FSC-A vs. SSC-A）、单细胞 （FSC-W vs. SSC-W） 和 B 细胞 （B220⁺CD5^-）。（B） B 细胞的 Indo-1/Ca²⁺ 通量反应（紫色与蓝色）。所示为相同蛋白质浓度 （2.5 μg/mL） 的抗 IgM Fab 片段脂质体和抗 IgM F（ab'）₂ 以及缓冲液刺激的细胞作为对照的钙通量。请注意，在 10-22 秒之间是添加刺激的时间，因此，在此期间不会采集任何数据。

材料