使用钙流检测法通过抗原性脂质体监测B细胞活化

摘要

来源：Bednar, K. J. 等，用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体。视觉化实验杂志 (2018)

本视频展示了利用抗原性脂质体评估B细胞活化的方法。使用钙敏感性染料Indo-1处理的B细胞通过流式细胞术进行区分，并分析其紫光到蓝光的荧光比值。当细胞接触到抗原性脂质体时，会通过钙离子内流触发B细胞活化，随时间推移逐步增强紫光到蓝光的荧光信号比值。

方案

1. 蛋白质抗原与聚乙二醇化脂质的偶联

1. 向一个250 mL的抽滤瓶中加入3 g分子筛范围为1,500–30,000道尔顿（Da）的交联葡聚糖凝胶珠，再加入60 mL磷酸盐缓冲液（PBS），并用磁力搅拌子持续搅拌。密封烧瓶后连接至真空泵，在搅拌器上抽真空至少1 h以开始脱气。
2. 在1.0 cm × 30 cm的玻璃层析柱中，关闭旋塞，加入PBS进行洗涤。打开旋塞，排空层析柱。洗涤后，将脱气的珠子悬液加入层析柱中。持续加入悬液，直至柱床高度达到约24 cm。
3. 当柱上端的 PBS 液面高出压实的凝胶约 4–5 cm 时，准备好以下步骤。
   1. 通过测量一段足够长的管子，使其能够延伸至高出柱子顶部1–2英尺的架子，并形成一个从柱子底部附近下降后返回柱子顶部的回路，从而建立一个重力流动虹吸系统。在管子的一端安装一个翻转塞，使管子的一侧保持开放。将开放端插入装有500 mL PBS的瓶子中，并将瓶子放置在柱子上方的架子上。
   2. 取带有翻转止流夹的一端，连接10 mL注射器。打开管路上的翻转止流夹阀门，通过导管吸取PBS。当PBS行进至导管四分之三长度时，迅速取下注射器，并将翻转止流夹安装到柱子顶端——液体应流入层析柱中。
      注意： 柱上残留的PBS液面高度应保持在1至3厘米之间。洗涤柱子的最小体积为3个柱体积。
4. 根据蛋白质的分子量（MW）确定需与脂质连接的蛋白质量（摩尔数）。
   注意： 此处使用山羊抗小鼠免疫球蛋白IgM的Fab片段（其本身为IgG）作为B细胞多克隆刺激的通用替代抗原。因此，山羊IgG的Fab片段分子量约为48千道尔顿（kDa），市售总量为1.3 mg，故需连接的蛋白量为27.1 µmol。
5. 测定目标蛋白的消光系数。若未知，可使用分光光度计测量蛋白在280 nm处的吸光度，并将A₂₈₀ 将该值除以步骤1.4中计算出的摩尔数。
   注意： 山羊IgG的Fab片段在280 nm处的消光系数为64,600 M⁻¹·cm⁻¹^-1.
6. 为确保去除含胺缓冲液的痕量残留，将蛋白质在步骤1.1–1.3中制备的层析柱上进行脱盐，并将蛋白质组分收集至1.5 mL微量离心管中（每管约500 µL）。
   1. 关闭连接到柱子顶部的翻转止流阀，并取下柱子的上部。如果柱子底部的翻转止流阀尚未打开，则将其打开，并等待 PBS 的液面升至凝胶珠顶部。
   2. 使用玻璃巴斯德吸管将目标蛋白缓慢加至凝胶珠上层，注意尽量减少对凝胶珠上层的扰动。
   3. 当蛋白溶液的“液面”到达凝胶珠顶部时，轻轻加入 1 mL PBS 通过 巴斯德移液管。重复三次。加入PBS以形成4–5厘米的液柱，并重复步骤1.3以洗涤层析柱。
      注意： 如果确定不存在含胺缓冲液，则可跳过此步骤。
7. 通过测定 A280 值确定含有蛋白的组分，并合并蛋白回收率约为 90% 的组分。
   注意： 这通常会使蛋白质稀释1.5至2倍。合并后测定蛋白质浓度。如有必要，可在此步骤中使用离心浓缩器对蛋白质进行浓缩。
8. 加入2.5摩尔当量的异双功能交联剂至蛋白质中。
   1. 首先，称取约 5 mg 的琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP，MW = 314 g/mol）至一微量离心管中。为确定溶解 SPDP 所需体积，将蛋白的摩尔浓度乘以 250，以配制 100 倍浓缩液，从而在反应中提供 2.5 倍的摩尔过量。
      注意： 例如，如果蛋白质浓度为 50 µM，则需要 12.5 mM 的 SPDP 溶液。对于 5 mg 的 SPDP，这相当于 1.27 mL 的二甲基亚砜（DMSO）。
9. 以1:100的稀释比例将SPDP加入目标蛋白中，在室温（RT）下置于振荡摇床上反应约1小时。
10. 为去除过量的SPDP并保护蛋白质在后续还原步骤中的内源性二硫键，用pH 5.5的100 mM醋酸钠（NaOAc）缓冲液平衡并洗涤在步骤1.1–1.3中制备的层析柱，或单独制备一个仅用于该缓冲液的相同层析柱。
11. 孵育 SPDP 1 小时后，将蛋白质在预平衡的柱子上进行脱盐，柱子使用 100 mM NaOAc 平衡。此步骤操作方式与步骤 1.6 完全相同，仅以 100 mM NaOAc（pH 5.5）作为洗脱液。收集洗脱组分，测定 A₂₈₀，合并上清组分。用 PBS 洗涤层析柱。
12. 配制 2.5 M DTT（分子量 = 154 g/mol）的双蒸水（ddH₂O）溶液₂O). 向合并的蛋白组分中加入 25 mM DTT，孵育 5–10 分钟。
13. 测量 A₂₈₀ 蛋白质的浓度，并将其除以消光系数。同时，测定 A₃₄₃. 根据蛋白质的摩尔浓度计算连接比率（A₂₈₀）和连接子（A₃₄₃).
    注意： 如果使用 Nanodrop 分光光度计，请关闭 A340 自动校准功能。A₃₄₃ 测量代表吡啶-2-硫酮基团的吸光度（消光系数 = 7550 M⁻¹cm⁻¹）^-1) 可被 DTT 从 SPDP 交联剂上解离下来。当使用 2.5 倍摩尔过量的 SDPD 与多种蛋白质反应时，通常可实现 1.2–1.5 的连接剂与蛋白质摩尔比。
14. 将混合的组分通过已用 PBS 洗涤过的层析柱（方法如上所述）。收集各组分，测定 A₂₈₀，合并上层组分。合并后通过A280测定蛋白质浓度。
15. 制备DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]-马来酰亚胺）。该试剂将以10:1的摩尔比加入蛋白质中。配制DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺的100倍浓缩液以达到所需浓度。
    1. 例如，如果在步骤1.14后蛋白浓度为10 µM，则配制10 mM的DSPE-PEG(2000)-Maleimide储备液。准确称取DSPE-PEG(2000)-Maleimide（分子量 = 3000 g/mol），加入适量DMSO溶解。可多次轻柔涡旋并超声处理以确保完全溶解。
16. 确定步骤1.14中各组分的总体积，并小心将溶液转移至一个小的（10–25 mL）圆底烧瓶（RBF）中。向蛋白溶液中加入适量的100倍浓缩DSPE-PEG(2000)-Maleimide，使终浓度为1倍、摩尔过量10倍。轻轻涡旋混合溶液，确保DMSO充分分散。
17. 在氮气保护下，将反应在密封的圆底烧瓶中过夜进行。使用橡胶隔膜密封，并置于通风橱内。
    1. 用连接在真空管路末端的3 mL注射器（装有20 G针头）穿刺隔膜以排出气氛，开启真空泵抽气3–5秒。
    2. 用氮气置换烧瓶内的气氛。将一个3 mL注射器（截去一半）上连接的气球充满氮气，并安装一根20 G针头。穿刺密封隔垫，向圆底烧瓶内通入氮气以置换内部气氛。重复抽换气一次（即抽真空后再充氮气），随后将充满氮气的气球保持连接过夜。
18. 在一根1.0 cm × 50 cm的玻璃层析柱中，另制备一单独的交联葡聚糖凝胶珠层析柱，其分级范围为4,000–150,000 Da（按步骤1.1–1.3进行）。
19. 次日，将步骤 1.17 中制备的圆底烧瓶中的蛋白质取出，并按照步骤 1.6 使用的方法，通过步骤 1.18 制备的交联葡聚糖凝胶珠柱进行层析。
    注意： 上样到柱子的总体积不应超过2 mL。如果反应体系较大，应分为两份分别上样至两个独立的柱子，或使用直径更大的柱子进行纯化。
    1. 收集组分，测定 A₂₈₀合并上层组分，并测定蛋白质浓度。脂质的存在不会影响测定结果。
20. 将最终合并的脂质结合蛋白组分于 4 °C 保存，直至使用前。

2. 脂质体的制备

1. 称取以下脂质：DSPE-PEG(2000)（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]，分子量 = 2805.5 g/mol）；胆固醇（3β-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3β-醇），分子量 = 386.7 g/mol；以及 DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱），分子量 = 790.1 g/mol。用氯仿分别配制浓度为 5 mg/mL 的 DSPC 溶液、4 mg/mL 的胆固醇溶液和 2 mg/mL 的 DSPE-PEG(2000) 溶液。
2. 确保脂质体中各脂质的摩尔比为：57% DSPC、38% 胆固醇和 5% DSPE-PEG(2000)，如表 1所示。
   注意：控制脂质体上抗原的含量非常重要，通常范围为 0.01–0.1%。在表 1中，使用了 0.1% 的与聚乙二醇化脂质连接的山羊抗小鼠 IgM Fab 片段。必须考虑在步骤 1.15 中加入蛋白时所添加的 DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺的 10 倍摩尔过量，以确保聚乙二醇化脂质的总量不超过 5%。
3. 在制备用于挤出的脂质时，需考虑最终脂质的总量（µmol）。参见表 1，了解如何计算脂质摩尔浓度，以制备总脂质浓度为 1.25 µM 的脂质体。
4. 在计算出每种脂质所需加入的准确量后，将所有脂质转移至一支 12 mL 的硼硅酸盐玻璃试管中。
5. 小心吹除氯仿。
   1. 使用步骤 1.17.1 中准备好的导管和带有针头的 3 mL 注射器，用氮气小心吹除试管中的氯仿。一只手轻轻将氮气流吹向溶液，同时另一只手缓慢旋转试管。注意尽量减少飞溅，或避免液体沿管壁上升过高，否则在下一步中可能更难将其完全溶解。
6. 向每支试管中加入 100 µL DMSO，并将该溶液在 -80 °C 冷冻后进行过夜冻干。用无静电实验室擦拭纸覆盖试管口，用橡皮筋固定后置于 -80 °C 冷冻。

3. 脂质体挤出

1. 将含有脂质连接蛋白的 1 mL PBS 加入含有脂质的 12 mL 管中。在超声水浴中对溶液超声处理约 30 秒至 1 分钟。每次超声后休息 5 分钟或更长时间，重复 3–4 次。
2. 按照制造商说明准备挤出器。
   1. 将滤膜支撑片放入内层膜支撑结构中，并在石蜡膜上滴加数滴（每滴 10 µL）PBS。使用镊子夹住滤膜支撑片边缘，将其浸入 10 µL 液滴中。
   2. 将滤膜放入 O 型圈内，两侧均需如此操作。用镊子夹住 0.8 µm 滤膜边缘，浸入 10 µL 液滴中，并用 PBS 涂覆 O 型圈外侧。将 0.8 µm 滤膜轻轻放置在 O 型圈上，确保滤膜不超出内层膜支撑结构的边缘。
3. 将挤出器加热块置于加热板上以预热挤出器。将加热板调至低温档，使加热块升至所需温度。为避免蛋白聚集的潜在问题，加热温度不得超过 37 °C。
4. 将超声处理后的样品加载至已安装在挤出器中的一个挤出用注射器内。将另一支空注射器插入挤出器的另一端。确保空注射器的推杆初始位置设为零。当脂质通过聚碳酸酯 0.8 µm 膜被挤出时，空注射器将逐渐充满。尽量避免气泡反复通过滤膜。
5. 将组装完整的挤出器放入加热块中。轻轻推动装有脂质的注射器推杆，使液体进入空注射器。根据脂质浓度不同，推动可能较为费力。重复此过程 20 次。
6. 从加热块中取出组装完整的挤出器。缓慢将装有样品的注射器从挤出器上取下，注意收集取下过程中可能泄漏的脂质。将脂质体转移至洁净小瓶中。使用聚碳酸酯 0.2 µm 和 0.1 µm 滤膜重复步骤 3.4–3.6。
7. 制备一根尺寸为 0.7 x 50 cm² 的交联琼脂糖珠层析柱，分离范围为 0.7–10 兆道尔顿（MDa），并用 PBS 平衡。加入脂质体并按步骤 1.6 进行层析。含有脂质体的组分在 250–400 nm 波长范围内的光透射率会降低。
8. 将脂质体在 4 °C 下保存，切勿冷冻。

4. 钙流检测抗原性脂质体对B细胞的激活作用

1. 根据机构的标准操作程序，使用二氧化碳（CO₂）或过量异氟烷对小鼠实施安乐死。通过颈椎脱位确认小鼠已安乐死。
2. 使用70%乙醇对手术器械和小鼠尸体进行消毒。使用10 cm长、0.8 mm尖端的弯头虹膜镊，将覆盖胸腔的皮肤与肋骨分离。使用10 cm长的直头解剖剪进行远端双侧切口。
3. 使用弯头虹膜镊和解剖剪从腹腔中取出脾脏。去除脾脏周围的脂肪组织，然后将其放入含有RPMI1640培养基（含1%胎牛血清（FCS）和青霉素-链霉素）的15 mL聚苯乙烯锥形管中。
4. 将脾脏和培养基转移至装有40 µm细胞筛并置于50 mL锥形管上的装置中。使用3 mL注射器活塞的橡胶端轻轻研磨脾脏。用培养基冲洗40 µm细胞筛。重复此过程，直至细胞筛中仅剩脂肪组织。用3–5 mL培养基冲洗筛网，以提高细胞回收率。
5. 将细胞匀浆在室温下以300 x g离心5分钟。离心后弃去上清液，并向沉淀中加入10 mL 1x红细胞裂解缓冲液。用移液器吹打混匀，在室温下静置2–3分钟，然后在室温下以300 x g离心5分钟。
6. 弃去上清液，将去除红细胞的脾细胞重悬于10 mL培养基中。使用血细胞计数板或其他细胞计数设备测定总细胞数。按上述方法通过离心收集细胞。
   注意：脾细胞负载Indo-1的理想终浓度为10–20 x 10⁶ 个细胞/mL，但也可使用较低浓度。
7. 将脾细胞以15 x 10⁶ 个细胞/mL的浓度重悬于钙流负载缓冲液中（RPMI1640培养基含1% FCS、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM氯化镁（MgCl₂）、1 mM乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）和5%青霉素-链霉素）。加入1.5 µM Indo-1（来自1 mM DMSO储备液），反复倒置混匀。避光，在37 °C水浴中孵育30分钟。
8. 30分钟孵育结束后，加入5倍体积的钙流负载缓冲液。在室温下以300 x g离心7分钟。
9. 为对B细胞设门，将细胞与1:200稀释的抗小鼠CD5-PE和1:200稀释的抗小鼠B220-PE/Cy7在0.5 mL负载缓冲液中于4 °C避光染色20分钟。
10. 用钙流负载缓冲液洗涤脾细胞，并在室温下以300 x g离心7分钟。将细胞重悬于钙流运行缓冲液（含1% FCS、1 mM MgCl₂和1 mM氯化钙（CaCl₂）的Hank's平衡盐溶液（HBSS））中，浓度为10–20 x 10⁶ 个细胞/mL。置于冰上避光保存，直至准备上流式细胞仪检测。
11. 设置未染色和单染对照样本用于补偿校正。
    1. 运行染色后的细胞以正确设门（见图1A）。设置Indo-1（紫光）vs. Indo-1（蓝光）散点图，调节Indo-1通道的电压，使细胞染色呈45–60°斜率，以最大化B细胞刺激后Indo-1紫光与蓝光比值变化的信噪比。
       注意：确保电压不过高，避免大量细胞（>5%）堆积在图的顶端。
    2. 创建一个对角门，覆盖图中左上区域（Violet⁺Blue^-），确保未刺激时门内细胞比例<10%，理想情况下刺激后应升至>75%。
12. 将0.5 mL细胞加入带盖的5 mL圆底聚苯乙烯管（荧光激活细胞分选（FACS）管）中，在水浴中37 °C预热3–5分钟。将FACS管放入连接循环水浴的37 °C水套室中。
    1. 将FACS管置于流式细胞仪的水套室内，开始采集数据（不存储），采集速率为约5,000–10,000个事件/秒。待细胞信号稳定（15–30秒）后，开始正式数据采集，并至少收集10秒以建立基线。
    2. 在第10秒时，迅速将FACS管从流式细胞仪中取出，加入刺激物（5–50 μM抗原性脂质体，体积2–20 μL），短暂涡旋混匀，然后立即将FACS管放回流式细胞仪。在此期间持续采集并存储数据，总采集时间持续3–5分钟。
13. 在合适的分析软件中使用动力学功能分析数据。

表1：制备总脂质浓度为1.25 µM的脂质体的计算方法。 山羊抗小鼠IgM F(ab)片段脂质体的计算表示例。

分子量	790	387	2900	3000	48000
	DSPC	胆固醇	PEG-DSPE	过量 PEG-DSPE	aIgM-PEG-DSPE	总计
摩尔比	57	38	3.9	1	0.1	100.00
质量 (mg)	0.56	0.18	0.14	0.04	0.06	0.98
毫摩尔 (mmol)	0.71	0.47	0.05	0.01	0.00	1.25
体积 (mL)	112.50	45.93	70.64	0.00	525.97	755.03
			浓度 (mg/mL)
		DSPC	5
		胆固醇	4
		PEG-DSPE	2
		aIgM-PEG-DSPE	0.114

结果

图1：代表性设门策略、钙流结果及分析。 （A）细胞分析采用以下设门策略：活淋巴细胞（FSC-A vs. SSC-A）、单细胞（FSC-W vs. SSC-W）以及B细胞（B220⁺CD5^-）。 （B）B细胞的Indo-1/Ca²⁺流反应（紫色 vs. 蓝色）。图中显示了在相同蛋白浓度（2.5 µg/mL）下，抗IgM Fab片段脂质体与抗IgM F(ab')₂的钙流情况，以及缓冲液刺激的细胞作为对照。注意，10–22秒之间为加入刺激物的时间，因此在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Model 2110 分部收集器	BioRad	7318122
胆固醇	Sigma	C8667	Sigma 级别 99%
SPDP	Thermo Fisher Scientific	21857
DSPC	Avanti	850365
DSPE-PEG 18:0	Avanti	880120
DSPE-PEG 马来酰亚胺	Avanti	880126
挤出器	Avanti	610000	带支架/加热块的 1 mL 注射器
0.1 µm 滤膜	Avanti	610005
0.8 µm 滤膜	Avanti	610009
10 mm 滤膜支撑架	Avanti	6100014
玻璃圆底烧瓶	Sigma	Z100633
翻转塞	Thermo Fisher Scientific	P-301398
管路	Thermo Fisher Scientific	P-198194
鲁尔锁接头	Thermo Fisher Scientific	k4201634503
Sephadex G50 葡聚糖凝胶珠	GE Life Sciences	17004201
Sephadex G100 葡聚糖凝胶珠	GE Life Sciences	17006001
热灭活胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10082147
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
EGTA	Sigma	E3889
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
1× 红细胞裂解缓冲液	Thermo Fisher Scientific	00-4333-57
Indo-1	Invitrogen	I1203
CD5-PE	BioLegend	100608
B220-PE-Cy7	BioLegend	103222
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14170112	不含钙和镁
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C4901
Fab 抗小鼠 IgM	Jackson ImmunoResearch	115-007-020
F(ab')2 抗小鼠 IgM	Jackson ImmunoResearch	115-006-020