使用超滤装置浓缩细菌培养滤液中的蛋白质

摘要

来源：Ryan, J. M., 等 结核分枝杆菌 通过尺寸排阻色谱法富集胞外囊泡。J. Vis. Exp. (183) (2022)

本视频演示了利用超滤法对细菌培养滤液蛋白（包括细菌胞外囊泡）进行分离和浓缩的过程。浓缩后的胞外囊泡可作为疾病检测的诊断标志物。

方案

1. 粗提物的制备 结核分枝杆菌 结核分枝杆菌（Mtb）细胞外囊泡（EV）浓缩物

注意：有关结核分枝杆菌（Mtb）培养及培养滤液蛋白（CFP）制备的详细步骤。建议细菌培养基中不含含有细胞外囊泡或蛋白质成分的生长补充剂（如油酸白蛋白葡萄糖催化酶，OADC）以及吐温等去垢剂。同时建议对细菌培养物的质量及收获的CFP进行检测，以确保细胞死亡和裂解程度有限。

1. 通过加入磷酸盐缓冲液（1× PBS）至100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤器的满容量体积来准备该过滤器（参见材料表）。在4 °C下以2,800 × g离心5分钟。
   注意：若使用无死体积限位的滤器，必须小心操作，确保样品体积不会低于滤膜水平，从而避免在离心中造成滤膜完全干燥。
2. 弃去滤过液及任何残留的PBS，然后将Mtb CFP加至样品室至其最大容量。在4 °C下以2,800 × g离心，直至体积减少至超滤装置的最小体积。根据需要重复此步骤，向装置中继续添加CFP，直到整个样品充分浓缩。
   注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100 kDa滤过液（100F）材料。储存于4 °C。
3. 向含有浓缩物的滤器中加入1× PBS....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动馏分收集器	IZON Science	AFC-V1-USD
Centricon Plus - 70 离心滤膜，100 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC710008	步骤 1.1 中使用的超滤装置
磷酸盐缓冲液（PBS），1X，不含钙和镁	Corning	21-040-CV
硝酸纤维素膜，卷状，0.2 μm	BioRad	1620112