一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

摘要

来源：Ryan, J. M., 等. 结核分枝杆菌 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡 J. Vis. Exp. (2022).

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的培养滤液中纯化细菌胞外囊泡（EVs）的技术。该技术采用填充多孔树脂的色谱柱，以获得纯化的EV组分。多孔颗粒可选择性地允许较小的蛋白质进入孔隙，从而延缓其洗脱；而由于EVs尺寸较大，无法进入孔隙，因此被排阻并率先洗脱出来。

方案

1. 结核分枝杆菌囊泡粗提物的制备

注意：有关结核分枝杆菌（Mtb）培养及培养滤液蛋白（CFP）制备的详细步骤，请参见参考文献。建议细菌培养基中不含含有细胞外囊泡或蛋白质成分的生长补充剂（如油酸白蛋白葡萄糖催化酶，OADC）以及吐温等去垢剂。同时建议对细菌培养物的质量及收获的CFP进行检测，以确保细胞死亡和裂解程度有限。

1. 通过加入磷酸盐缓冲液（1× PBS）至100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤器的满容量，准备该过滤器（参见材料表）。在4 °C条件下，以2,800 × g离心5分钟。
   注意：若使用无死体积限位的过滤器，需特别注意避免样品体积减少至低于滤膜水平，以防在离心过程中滤膜完全干燥。
2. 弃去滤过液及任何残留的PBS，然后将Mtb CFP加入样品室至其最大容量。在4 °C条件下，以2,800 × g离心，直至体积减少至超滤装置的最小体积。根据需要重复此步骤，向装置中继续添加CFP，直至整个样品充分浓缩。
   注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100 kDa滤过液（100F）材料。储存于4 °C。
3. 向含有浓缩物的过滤装置中加入1× PBS至装置的总容量。按照步骤1.2所述方法再次浓缩体积。重复此步骤五次，以确保充分洗涤和缓冲液置换。
4. 根据超滤装置的规格回收100 kDa浓缩后的CFP截留物（100R）（参见材料表）。回收100R后，用最小体积的1× PBS至少冲洗滤膜三次，并将冲洗液与100R合并，以最大化回收率。
5. 按照制造商说明书使用二辛可宁酸法（BCA）对100R材料进行定量（参见材料表）。进行测定时，将样品用PBS稀释为1:2、1:5和1:10等多个稀释度，并每个样品设三个重复孔进行检测。
   注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100R材料。储存于4 °C。

2. 利用尺寸排阻色谱法从CFP中富集结核分枝杆菌EVs

注意：以下步骤专为使用 3 mg 的 100R Mtb CFP 并结合 SEC 柱和自动组分收集器（AFC，参见材料表）而设计。通过遵循制造商的说明，该方法可适用于其他起始浓度和柱类型。此外，建议使用者阅读并理解自动组分收集器的用户手册。

1. 让凝胶过滤层析柱平衡至室温。
2. 通过塔式单元背面的电源开关打开自动组分收集器（AFC），如有必要，在主菜单触摸屏上按下SETUP，调整称重传感器的设置。称重传感器仅在首次使用、每次软件更新后，或发现组分收集体积不一致时才需要校准。
3. 在SETUP界面中，选择CAROUSEL > CALIBRATE以校准转盘。将带有13个小孔且孔朝上的转盘插入AFC塔中，并通过按下-和/或+按钮，调整转盘位置，使液体喷嘴正对冲洗位置。
4. 取下已平衡的凝胶过滤层析柱的盖子。将层析柱滑入合适的柱架中，并小心地安装到AFC塔上。确保柱上的射频识别（RFID）标签朝向AFC，并检查柱与阀门之间的连接是否牢固。将废液出口管放入废液收集容器中。
5. 在SETUP界面中，选择Collection Schedule，通过按下-和/或+按钮，将计数设为13，体积设为0.5 mL。将“Buffer Volume”设置保留默认值2.7 mL，然后按下X关闭“Collection Schedule”窗口。
6. 从主界面选择START COLLECTION，并通过选择YES确认收集参数。将13个已标记且管盖打开并朝向转盘中心的1.7 mL微量离心管装入转盘。
7. 选择OK推进AFC，然后安装柱储液槽并再次按下OK推进。按下YES选择冲洗柱的选项，并加入一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS，以去除任何保存缓冲液。冲洗完成后，按下OK推进AFC。
8. 将转盘盖盖在AFC上，然后按下OK。准备一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS。使用移液器去除柱中多余的缓冲液。
9. 将步骤1.5中定量的3 mg 100R样品用1x PBS稀释至500 µL。将3 mg样品加至柱顶部。推进AFC，使样品流入筛板。待样品完全进入柱后，将步骤2.6中准备的PBS加入储液槽中。
10. 监测AFC运行过程，其将首先收集空体积，然后按设定收集指定的组分。运行结束后，转盘返回废液位置，取下盖子并从转盘中取出组分收集管。在定量（步骤3）和定性（步骤4）前，将组分储存于4 °C。
11. 若需重复使用该柱，请按下YES选择清洗柱的选项；否则按下NO。请遵循AFC上的操作提示。
    注：柱清洗完毕且保存缓冲液流过后，可将其取下，盖上盖子，并于4 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Corning	15705-066
自动馏分收集器	IZON Science	AFC-V1-USD
台式离心机	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 离心滤膜，100 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC710008	步骤 1.1 中使用的超滤装置
磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁	Corning	21-040-CV
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23225
qEV Original 35 nm 5/包	IZON Science	SP5-USD	尺寸排阻色谱柱（SEC柱）