一种定量斑马鱼幼鱼真菌感染的技术

摘要

来源：Thrikawala, S., 等. 斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子 视频实验杂志 (2020).

本视频展示了一种定量检测斑马鱼幼鱼真菌感染的方法。将真菌孢子显微注射至幼鱼后脑室，随后孵育以促进感染发展。在预定时间点收集感染幼鱼，并通过计数菌落形成单位来评估感染进展。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备 曲霉属 用于注射的孢子

1. 从 Aspergillus 孢子悬液中计算获得 1 × 10⁶ 个孢子所需的体积。该体积应为 20–100 μL；若不符合，则用 0.01%（v/v）无菌 Tween-20（Tween-水；材料表）进行 10 倍稀释。例如，若计算出的体积为 5 µL，则进行 10 倍稀释，并使用 50 µL 稀释后的溶液。
   注意：可为每种菌株准备两个平板，以收集更多孢子，或作为污染情况下的备用。
2. 在生物安全柜中，使用无菌一次性 L 形涂布棒将 1 × 10⁶ 个 Aspergillus 孢子均匀涂布于一个葡萄糖基本培养基（GMM）平板（材料表）上。避免将孢子涂布至平板边缘。将平板倒置，在 37 °C 下培养 3–4 天。
3. 在收集当天，将无菌 Miracloth 滤布和 50 mL 锥形管（每种菌株各两个）、新鲜的无菌 Tween-水瓶（每种菌株各一瓶）以及无菌一次性 L 形涂布棒带入生物安全柜。
   注意： Miracloth 可裁剪成约 8 英寸 × 6 英寸的片状，用铝箔包裹后高压灭菌以实现灭菌。
4. 在每个已标记的 50 mL 锥形管中放入一片 Miracloth，盖上盖子。将剩余的 Miracloth 包装从操作台中取出。
5. 将平板带入生物安全柜。打开一个平板，然后倒入 Tween-水，使其覆盖约四分之三的平板表面。
6. 使用一次性 L 形涂布棒，以左右往复的方式轻轻刮擦真菌培养物表面，同时用另一只手旋转平板。持续刮擦，直至几乎所有孢子均被均匀分散到 Tween-水中。
   注意： 由于孢子具有高度疏水性，在加入 Tween-水或刮擦过程中可能形成“团块”。应格外小心，避免污染附近的试管或平板。建议在提取不同菌株之间更换手套，并用 70% 乙醇擦拭操作台表面。
7. 取一个 50 mL 锥形管，取出其中的 Miracloth 片。将其对折，制成过滤器并插入 50 mL 锥形管顶部。
8. 将平板中的真菌匀浆液通过 Miracloth 过滤至锥形管中。
   注意： 若为同一种菌株准备了两个平板，则应将两个平板的刮取物均倒入同一个锥形管中。
9. 加入 Tween-水，使锥形管中的总体积达到 50 mL。
10. 在离心机中以 900 × g 离心 10 分钟。确保使用防气溶胶盖的离心管。
11. 将上清液倒入约 10% 的次氯酸钠溶液中以进行去污处理。向锥形管中加入 50 mL 无菌 1× PBS，然后涡旋或振荡以重悬沉淀。
12. 再次以 900 × g 离心 10 分钟。倒去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 无菌 1× PBS 中，并通过一片新的 Miracloth 过滤至一个新的 50 mL 锥形管中。
13. 在 1.7 mL 离心管中对真菌匀浆液进行 10 倍系列稀释（10 倍、100 倍、1000 倍）（例如，对于 10 倍稀释液，将 100 µL 真菌匀浆液与 900 µL Tween-水混合）。
14. 选择在将稀释液滴入 Tween-水后孢子不可见的第一个稀释度，并使用该稀释度通过血细胞计数板计数孢子数量。
15. 使用以下公式计算所制备真菌匀浆液（水悬液）中的孢子浓度：
    浓度（孢子/mL）= 中央 25 个方格中的孢子数 × 稀释倍数 × 10⁴
16. 在 1.7 mL 微量离心管中，用无菌 1× PBS 制备 1 mL 浓度为 1.5 × 10⁸ 孢子/mL 的孢子储备液。该孢子悬液可在 4 °C 下保存约 4 周。
17. 在用于注射前，于 1.7 mL 离心管中将 20 µL 孢子悬液与 10 µL 1% 无菌酚红混合，以获得终浓度为 1 × 10⁸ 孢子/mL 的孢子悬液。注射前充分涡旋混匀。
    注意： 1% 酚红溶液应经过滤除菌，并分装保存。
18. 对于模拟注射，将 20 µL 1× PBS 与 10 µL 1% 无菌酚红混合。

2. 注射用琼脂平板的制备

1. 在微波炉中融化含有2%琼脂糖的E3培养基。
2. 将融化的琼脂糖溶液倒入100 mm × 15 mm的培养皿中（每皿约25 mL），轻轻旋转培养皿使液体均匀覆盖底部，静置冷却。
3. 用封口膜包裹培养皿，并倒置于4 °C保存。
4. 注射前，将培养皿恢复至室温（RT）。
5. 向培养皿中加入约1 mL经过滤除菌的2%牛血清白蛋白（BSA）溶液，倾斜培养皿使液体均匀铺展并覆盖整个底部，随后用E3培养基冲洗。
   注意：2% BSA溶液可过滤除菌后分装为1 mL等份，于-20 °C保存。预先使用2% BSA处理可防止幼虫粘附在琼脂糖表面。
6. 向培养皿中加入含缓冲三卡因（tricaine）的E3培养基，静置直至进行注射。

3. 斑马鱼幼体后脑室显微注射

1. 在受精后2天（dpf），于培养皿中使用镊子手动去除幼鱼的卵膜。
   注意：去膜操作可在1.5 dpf至注射时间之间的任意时刻进行。
2. 尽可能移除培养皿中的E3培养液，并加入含缓冲液的300 µg/mL三卡因（tricaine）E3溶液以麻醉幼鱼。
   注意：可预先配制含缓冲液的4 mg/mL三卡因E3储备液，于4 ˚C保存。工作液可通过将4 mL储备液用E3定容至50 mL制得。
3. 使用配备压力注射仪、背压装置、脚踏开关、微移液器夹持器、显微操作器以及磁性支架和注射板的微注射装置（材料表），并将其全部连接至压缩空气源。
4. 打开压缩空气阀门并启动显微注射仪。将压力设为约25 PSI，脉冲持续时间为60 ms，背压装置设为1 PSI。
5. 使用微载样吸头（材料表）将约3–5 µL预先配制的PBS或含酚红的孢子悬液装入微注射针中。将注射针安装至显微操作器上。
   注意：微注射针的制备方法可参照先前描述。用于微注射的体视显微镜应配备目镜测微尺，以校准微注射针。需使用台式显微尺对目镜测微尺进行校准，并确定测微尺刻度的长度（µm）。根据测微尺刻度线与喷出液滴重叠的数量，测量从针尖喷出的孢子悬液滴的直径。
6. 调整显微操作器位置，使针尖在体视显微镜最低放大倍数下可见。将放大倍数调至4倍，保持针尖在视野中。
7. 使用尖头镊子剪断针尖。踩下注射踏板以观察喷出液滴的大小。持续剪短针尖，直至每次注射量约为3 nL的孢子悬液（此处对应五个刻度）。
8. 将显微操作器和注射针移开，避免在排列幼鱼时意外触碰针尖。
9. 倒掉注射板上的E3-三卡因溶液，然后使用转移吸头将约24条麻醉后的幼鱼尽可能少地带液转移至注射板上。
10. 使用操作斑马鱼幼鱼的小工具（如毛发环工具或睫毛工具），按幼鱼朝向进行排列：将所有朝右的幼鱼排成一行，所有朝左的排在下一行。
    注意：若板上液体过多，幼鱼会“漂浮”移位，导致排列困难；但若液体过少，且注射耗时较长，则幼鱼可能干燥或麻醉效果消退。因此，在整个微注射过程中应密切注意板上液体量。
11. 将显微镜放大倍数调至最低。将显微操作器移回，并调整位置，使针尖接近幼鱼，与视野中心呈约30˚–60˚角。
12. 放大至最高倍数，使用微调旋钮进一步调整针尖位置。通过将孢子悬液注射到幼鱼旁的液体中，观察是否有约30–70个孢子喷出，以确认注射量。如有必要，调整注射装置的时间和压力参数。
    注意：由于针尖喷出的孢子数量可能随时间变化，每注射5至6条幼鱼后应重复此测试。
13. 从幼鱼朝向针尖的一行开始，移动注射板，使针尖正对并靠近第一条幼鱼。
14. 使用显微操作器移动针尖，将其插入耳囊周围的组织，穿透至后脑室。必要时用另一只手移动注射板，以调整幼鱼体位与针尖角度的相对位置。
15. 目视确认针尖位于后脑室中央，踩下脚踏开关注入孢子，然后缓慢撤回针尖。
    注意：酚红染料应主要停留在后脑室内。少量可进入中脑，但不应到达前脑或脑外区域。若出现上述情况，说明注射体积过大，应相应降低压力和时间，或重新校准新针头。
16. 沿注射板依次完成该行所有幼鱼的注射。随后翻转注射板，对另一行幼鱼进行注射。
    注意：对于注射失败或意外损伤的幼鱼，可通过以下方式标记：1）向卵黄内多次注射以形成红色标记；或2）用针尖将幼鱼从排列行中拖出。
17. 再次将针尖移开。将显微镜倍数调低。每条幼鱼后脑中的酚红染料应仍清晰可见。
18. 首先使用毛发环工具和吸头移除所有注射失败的幼鱼并弃置。用新鲜无菌E3培养液冲洗剩余幼鱼，通过转移吸头将其转移至新的培养皿中。
19. 根据实验所需最终样本量，重复上述步骤。
20. 用E3培养液至少冲洗幼鱼两次，并确保其从麻醉状态中恢复。
21. 如需在不进行任何进一步处理的情况下量化存活率，使用转移吸头将幼鱼转移至96孔板中（每孔1条幼鱼），加入E3培养液。

4. 注射孢子数量与可存活孢子数量的确定

1. 注射后立即使用移液管随机挑选约八只已注射的幼虫，并将其分别转移至1.7 mL离心管中（每管一只幼虫）。
2. 使用三卡因（tricaine）或将幼虫置于4 °C环境中0.5–2.0小时，以实施安乐死。
3. 在无菌1x PBS中配制1 mL浓度为1 mg/mL的氨苄青霉素和0.5 mg/mL的卡那霉素抗生素溶液。剩余溶液可于4 °C保存，供后续使用。
   注意：可预先配制浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素和50 mg/mL的卡那霉素储备液，经滤膜除菌后分装，于-20 °C保存。使用时用1x PBS稀释100倍，获得工作浓度溶液。
4. 使用移液器尽可能吸除离心管中的液体，保留幼虫，随后加入90 µL含抗生素的1x PBS。
   注意：添加抗生素旨在防止GMM平板中细菌生长，以免干扰Aspergillus菌落的计数。
5. 在组织研磨仪中以1,800次振荡/分钟（30 Hz）均质化幼虫6分钟，随后以17,000 x g离心30秒。
6. 标记GMM平板（每只均质化幼虫对应一个平板）。在本生灯火焰附近建立无菌环境，将一根离心管中的均质化悬液移至GMM平板中央，使用一次性L型涂布棒均匀涂布。避免将匀浆液涂至平板边缘。
7. 将平板倒置于37 °C培养2–3天，计数形成的菌落数量（CFU）。
8. 为测定感染期间存活孢子的数量，可在注射后1–7天（dpi）从96孔板中取出幼虫并转移至离心管。按照步骤4.1–4.5所述方法进行安乐死、均质化处理，并将匀浆液涂布于GMM平板上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #5 镊子	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
目镜测微尺	Microscope World	RETR10	用于校准针头，配合体视显微镜使用
显微注射装置：背压单元	Applied Scientific Instrumentation	BPU
脚踏开关	Applied Scientific Instrumentation	FTSW
微量移液器持针器套件	Applied Scientific Instrumentation	M-Pip
压力注射仪	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
显微操作装置：显微操作器	Narashige (Tritech)	M-152
磁力支架和底板	Tritech	MINJ-HBMB
玻璃毛细管拉制仪	Sutter Instrument	P-97
体视显微镜	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	85300	用于匀浆幼虫样品
材料
琼脂糖	Fisher	BP160-500
氨苄青霉素钠盐	Fisher	AAJ6380706
牛血清白蛋白，第 V 组分	VWR	AAJ65855-22
卡那霉素硫酸盐	Fisher	AAJ1792406
L 型涂布棒	Fisher	14 665 230
微毛细管注射针（无内丝）	World Precision Instruments (WPI)	TW100-3
微量移液器加样尖（Microloader）	VWR	89009-310	用于将曲霉菌悬液装入注射针
Miracloth 过滤布	VWR	EM475855-1R	用于过滤曲霉菌悬液
N-苯基硫脲	Fisher	AAL0669009	用于防止色素沉积
酚红，1% 溶液	Fisher	57254
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Fisher	AC118000500	用于麻醉幼虫
吐温-20	Fisher	BP337-500
培养基与溶液			成分/配方
E3 培养基：60x E3			17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O，加 H2O 至 1 L
1x E3			16.7 ml 60x 储液，430 µl 0.05 M NaOH，加 H2O 至 1 L（可选：+ 3 ml 0.01% 亚甲蓝）
三卡因储备液			2 g 三卡因，5 g Na2HPO4 · 7H2O，4.2 ml 60X E3，加 H2O 至 500 ml，用 NaOH 调 pH 至 7.0–7.5
葡萄糖基本培养基（GMM）琼脂：GMM 琼脂			10 g 葡萄糖（右旋糖），50 ml 20x 硝酸盐溶液，1 ml TE，加 H2O 至 1 L，用 NaOH 调 pH 至 6.5，加入 16 g 琼脂，高压灭菌
20x 硝酸盐溶液			120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g MgSO4 · 7H2O, 30.4 g KH2PO4，加 H2O 至 1 L，高压灭菌
微量元素（TE）			2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA，加 H2O 至 100 ml，搅拌过夜溶解，高压灭菌