一种用于观察真菌病原体感染的斑马鱼幼鱼的zWEDGI技术

摘要

来源：Thrikawala, S. 等人 斑马鱼幼鱼感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子。 视频实验杂志 (2020)

该视频展示了一种用于观察荧光标记真菌病原体感染斑马鱼幼鱼的斑马鱼损伤与捕获装置技术。初始感染会吸引巨噬细胞，随着感染持续，中性粒细胞在注射部位逐渐被招募。

方案

1. 注射用 Aspergillus 孢子的制备

1. 从一 Aspergillus 孢子悬液中，计算获得 1 × 10⁶ 个孢子所需的体积。该体积应为 20–100 μL；若不符合，则用 0.01% (v/v) 无菌 Tween-20（Tween-水； 材料表）进行 10 倍稀释。例如，若计算体积为 5 µL，则制备 10 倍稀释液，并取 50 µL 稀释液使用。
   注意：可制备两个平板/菌株以收集更多孢子，或作为污染情况下的备用。
2. 在生物安全柜中，使用无菌一次性 L 形涂布棒将 1 × 10⁶ 个 Aspergillus 孢子均匀涂布于一个葡萄糖基本培养基（GMM）平板（材料表）上。避免将孢子涂至平板边缘。将平板倒置，于 37 °C 培养 3–4 天。
3. 在收集当天，将无菌 miracloth 和 50 mL 锥形管（每菌株两个）、新鲜的无菌 Tween-水瓶（每菌株一瓶）以及无菌一次性 L 形涂布棒带入生物安全柜。
   注意：miracloth 可裁剪为约 8 英寸 × 6 英寸的片状，用铝箔包裹后高压灭菌以实现灭菌。
4. 在每个标记好的 50 mL 锥形管中放入一片 miracloth，盖上盖子。将剩余的 miracloth 包从操作台中取出。
5. 将平板带入生物安全柜。打开一个平板，倒入 Tween-水，使其覆盖约四分之三的平板表面。
6. 使用一次性 L 形涂布棒轻轻前后刮擦真菌培养物表面，同时用另一只手旋转平板。持续刮擦，直至几乎所有孢子均均匀分散于 Tween-水中。
   注意：由于孢子具有高度疏水性，在加入 Tween-水或刮擦过程中可能形成“团块”。应格外小心，避免污染邻近的试管或平板。建议在提取不同菌株之间更换手套，并用 70% 乙醇擦拭台面。
7. 取一个 50 mL 锥形管，取出其中的 miracloth 片。将其对折，制成滤器，插入 50 mL 锥形管口。
8. 将平板中的真菌匀浆液通过 miracloth 过滤至锥形管中。
   注意：若某一菌株制备了两个平板，则刮取两个平板的孢子 并倒入同一个锥形管中。
9. 加入 Tween-水，使锥形管中总体积达到 50 mL。
10. 以 900 × g 离心 10 分钟。离心时务必使用防气溶胶盖。
11. 将上清液倒入约 10% 的次氯酸钠溶液中以去污染。向锥形管中加入 50 mL 无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋或震荡以重悬沉淀。
12. 再次以 900 × g 离心 10 分钟。倒去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 无菌 1× PBS 中。通过一片新的 miracloth 过滤至一个新的 50 mL 锥形管中。
13. 在 1.7 mL 离心管中对真菌匀浆液进行 10 倍系列稀释（10 倍、100 倍、1000 倍）（例如，对于 10 倍稀释液，将 100 µL 真菌匀浆液与 900 µL Tween-水混合）。
14. 选择在滴加至 Tween-水中时孢子不可见的第一个稀释度，并使用该稀释度通过血细胞计数板计数孢子数量。
15. 使用以下公式计算所制备真菌匀浆液（水悬液）中的孢子浓度：
    浓度（孢子/mL）= 中央 25 个方格中的孢子数 × 稀释倍数 × 10⁴
16. 在 1.7 mL 微离心管中，用无菌 1× PBS 制备 1 mL 含 1.5 × 10⁸ 个孢子/mL 的孢子储备液。该孢子悬液可在 4 °C 下保存约 4 周。
17. 在用于注射前，于 1.7 mL 离心管中将 20 µL 孢子悬液与 10 µL 1% 无菌酚红混合，使最终孢子浓度达到 1 × 10⁸ 个孢子/mL。注射前充分涡旋混匀。
    注意：1% 酚红溶液应经滤膜除菌，并分装保存。
18. 进行模拟注射时，将 20 µL 1× PBS 与 10 µL 1% 无菌酚红混合。

2. 注射用琼脂平板的制备

1. 在 E3 培养基中配制 2% 琼脂糖，用微波炉融化。
2. 倒入 100 mm × 15 mm 的培养皿中（每皿约 25 mL），轻轻旋转使液体均匀覆盖皿底，静置冷却。
3. 用石蜡膜包裹培养皿，倒置于 4 °C 保存。
4. 注射前将培养皿恢复至室温（RT）。
5. 向培养皿中加入约 1 mL 经滤膜除菌的 2% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，倾斜培养皿使液体均匀铺展并覆盖整个底部，然后用 E3 培养基冲洗。
   注意：2% BSA 溶液可经滤膜除菌后分装为 1 mL 份量，于 -20 °C 保存。预先使用 2% BSA 处理可防止幼虫黏附在琼脂糖表面。
6. 向培养皿中加入含缓冲三卡因的 E3 培养基，静置至注射前。

3. 斑马鱼幼虫后脑室微注射

1. 在2 dpf时，使用镊子在培养皿中手动去除幼鱼的卵膜。
   注意：去膜操作可在1.5 dpf至注射时间之间的任何时段进行。
2. 尽可能移除培养皿中的E3培养基，并加入含缓冲液的300 µg/mL三卡因（tricaine）E3溶液以麻醉幼鱼。
   注意：可预先配制含缓冲液的4 mg/mL三卡因E3储备液，并于4 ˚C保存。工作液可通过将4 mL储备液用E3定容至50 mL制得。
3. 使用配备压力注射仪、背压装置、脚踏开关、微移液器夹持器、显微操作器以及磁力支架和注射板的微注射装置（材料表）。
4. 打开压缩空气阀门并启动微注射仪。将压力设为约25 PSI，脉冲持续时间设为60 ms，背压装置设为1 磅每平方英寸（PSI）。
5. 使用微加样吸头（材料表）向微注射针中加载约3–5 µL含酚红的预配PBS或孢子悬液。将注射针安装至显微操作器上。
   注意：微注射针的制备方法可参照先前描述。用于微注射的体视显微镜应配备目镜测微尺以校准注射针。需使用台式显微尺对测微尺进行校准，并确定测微尺刻度的长度（µm）。根据测微尺刻度线与液滴重叠的数量，测量从针尖喷出的孢子悬液滴的直径。
6. 调整显微操作器位置，使针尖在体视显微镜最低放大倍数下可见。将放大倍数调至4倍，保持针尖在视野中。
7. 使用尖头镊子剪断针尖。踩下注射踏板以观察喷出液滴的大小。持续剪切针尖直至每次注射量约为3 nL的孢子悬液（此处对应五个刻度）。
8. 将显微操作器和注射针移开，避免在排列幼鱼时意外触碰针尖。
9. 倒掉注射板上的E3-三卡因溶液，然后使用转移吸管将约24条麻醉后的幼鱼转移至注射板，尽量减少携带的E3液体量。
10. 使用操作斑马鱼幼鱼的小工具（如毛发环工具或睫毛工具），按幼鱼朝向进行排列：将所有朝右的幼鱼排成一行，所有朝左的排在下一行。
    注意：若板上液体过多，幼鱼会“漂浮”移位，导致排列困难；但若液体过少，且注射耗时较长，幼鱼可能脱水或麻醉效果消退。因此，在整个微注射过程中应密切注意板上液体量。
11. 将显微镜放大倍数调至最低。将显微操作器移回并调整位置，使针尖接近幼鱼，与视野中心呈约30˚–60˚角。
12. 放大至最高倍数，使用微调旋钮进一步调整针尖位置。通过将孢子悬液注射到幼鱼旁的液体中，观察是否有约30–70个孢子喷出。如有必要，调整注射装置的时间和压力。
    注意：由于针尖喷出的孢子数量可能随时间变化，每注射5至6条幼鱼后应重复此测试。
13. 从幼鱼朝向针尖的一行开始，移动注射板，使针尖正对并靠近第一条幼鱼。
14. 使用显微操作器移动针尖，将其穿过耳囊周围的组织，刺入后脑室。必要时用另一只手移动注射板，以调整幼鱼方向与针尖角度的相对位置。
15. 目视确认针尖位于后脑室中央，踩下脚踏开关注入孢子，然后缓慢撤回针尖。
    注意：酚红染料应主要停留在后脑室内。少量可进入中脑，但不应到达前脑或脑外区域。若出现上述情况，说明注射体积过大，应相应降低压力和时间，或重新校准新针头。
16. 沿注射板依次完成该行所有幼鱼的注射。随后翻转注射板，对另一行幼鱼进行注射。
    注意：对于注射失败或意外损伤的幼鱼，可通过以下方式标记：1）向卵黄内多次注射以形成红色标记；或2）用针尖将幼鱼从排列中拖出。
17. 再次将针尖移开。将显微镜倍数调低。每条幼鱼后脑中的酚红染料应仍清晰可见。
18. 首先使用毛发环工具和吸管移除所有注射失败的幼鱼并弃置。用新鲜无菌E3培养基冲洗剩余幼鱼，将其转移至新的培养皿中。
19. 根据实验所需最终样本量，重复上述步骤。
20. 用E3培养基至少冲洗幼鱼两次，并确保其从麻醉状态中恢复。
21. 如需在不进行额外处理的情况下量化存活率，使用转移吸管将幼鱼转移至96孔板（每孔1条幼鱼），加入E3培养基。

4. ​确定注射的和具有活力的孢子数量

1. 注射后立即使用移液管随机挑选约八只已注射的幼虫，分别转移至1.7 mL离心管中（每管一只幼虫）。
2. 使用三卡因（tricaine）或将幼虫置于4 °C环境中0.5–2.0小时，以实施安乐死。
3. 在无菌1x PBS中配制1 mL浓度为1 mg/mL的氨苄青霉素和0.5 mg/mL的卡那霉素抗生素溶液。剩余溶液可储存于4 °C，后续使用。
   注意：可预先配制100 mg/mL氨苄青霉素和50 mg/mL卡那霉素的储存液，经滤膜除菌后分装，于-20 °C保存。使用时用1x PBS稀释100倍，获得工作浓度溶液。
4. 使用移液器尽可能吸除离心管中的液体，保留幼虫，随后加入90 µL含抗生素的1x PBS。
   注意：添加抗生素旨在防止GMM平板中细菌生长，避免干扰 Aspergillus 菌落的计数。
5. 在组织研磨仪中以1,800次振荡/分钟（30 Hz）均质化幼虫，持续6分钟。随后以17,000 x g 离心30秒。
6. 标记GMM平板（每只均质化幼虫对应一个平板）。在本生灯火焰附近建立无菌环境，将一根离心管中的均质化悬液移至GMM平板中央，使用一次性L型涂布棒均匀涂布。避免将匀浆液涂至平板边缘。
7. 将平板倒置于37 °C培养2–3天，计数形成的菌落数量，即菌落形成单位（CFU）。
8. 为测定感染期间存活孢子的数量，可在注射后1–7天（dpi）从96孔板中取出幼虫并转移至离心管。按照步骤4.1–4.5所述方法进行安乐死、均质化处理，并将匀浆液涂布于GMM平板上。

5. 注射后幼虫的药物处理

1. 在第4步之后，将剩余的已注射幼体分成两份，分别放入两个3.5 mm的培养皿中：一份用于药物处理，另一份作为对照。每组条件使用约24只感染的幼体。
   注意： 3.5 mm培养皿可预先用2%脱脂奶粉水溶液处理，冲洗后晾干，并在室温下储存。用奶粉包被可防止幼体粘附在塑料表面。
2. 根据所需终浓度，在锥形管中用不含亚甲蓝的E3培养基配制目标药物溶液及其溶剂对照，充分混匀。例如，若需监测暴露于地塞米松的幼体存活情况，则应设置地塞米松组（24只幼体，重复数）和溶剂对照组（如二甲基亚砜，DMSO），每组各24只幼体。配制5 mL所需浓度的药物溶液。此处使用了5 mL含0.1% DMSO和10 µM地塞米松的溶液，并将每组约24只幼体转移至含有约200 µL溶剂/药物溶液与幼体的混合液中。
3. 用移液器尽可能吸除其中一个培养皿中的液体，加入预先混合好的含溶剂对照的E3培养基。对另一个培养皿重复此操作，加入含有目标处理药物的预混E3培养基。
4. 使用移液器将幼体转移至96孔板中（每孔一只幼体）。持续监测暴露于溶剂或药物的已注射幼体在7天内的存活情况。
   注意： 药物可在感染当天一次性加入，并在整个实验期间持续保留在幼体环境中，也可选择每日更换新鲜药物溶液。

6. 使用斑马鱼创伤与捕获成像生长装置（zWEDGI）对感染幼鱼进行每日成像

1. 在24 hpf时用100 µM N-苯基硫脲（PTU）处理幼鱼，以防止色素形成，并在整个实验过程中持续保留PTU。
   注意：75–100 µM的PTU可有效抑制幼鱼色素形成，且不会引起明显的发育异常。然而，PTU可能干扰某些生物学过程，研究人员应预先确定该药物是否会影响所研究的任何过程。
2. 在2 dpf时，按照第3节所述方法，用表达荧光蛋白的标记细胞群体感染转基因幼鱼，所用为经基因工程改造的 Aspergillus 孢子。随后将感染后的幼鱼转移至48孔板中，每孔约500 µL不含亚甲蓝的E3培养基。
   注意：此处使用48孔板是因为在每日重复成像过程中更便于幼鱼的转移操作。
3. 在成像当天，准备两个3.5 mm的培养皿：一个含有100 µM PTU，另一个含有E3-三卡因（E3-tricaine）。
4. 向zWEDGI装置的腔室中加入E3-三卡因。在体视显微镜下，使用P100微量移液器去除腔室及限制通道中的气泡。清除所有多余的E3-三卡因，仅保留腔室内的液体。
5. 使用转移移液器从孔板中吸取一条幼鱼。若转移时带入较多液体，先将其移入含有E3-PTU的3.5 mm培养皿中。然后再次吸取，尽量减少携带液体量，并转移至E3-三卡因中。
6. 等待约30秒以完成麻醉，随后将幼鱼转移至损伤与捕获装置（如zWEDGI）的加载腔室中。
7. 在体视显微镜下调整幼鱼位置。使用P100微量移液器从损伤腔室中吸出E3-三卡因，并释放至加载腔室，推动幼鱼尾部进入限制通道。确保幼鱼侧卧、背朝上或背外侧朝上，以便使用倒置物镜对后脑进行成像。
8. 使用共聚焦显微镜对幼鱼进行成像。
9. 成像完成后，使用P100移液器将E3-三卡因重新注入损伤腔室，推动幼鱼从限制通道返回至加载腔室。
10. 使用转移移液器拾取幼鱼，并将其转移回含有E3-三卡因的培养皿中。尽量减少携带液体量，再将其转移至含有E3-PTU的培养皿中。在PTU中冲洗后，放回48孔板中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #5 钳子	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
目镜测微尺	Microscope World	RETR10	用于校准针头，配合体视显微镜使用
显微注射装置：背压单元	Applied Scientific Instrumentation	BPU
脚踏开关	Applied Scientific Instrumentation	FTSW
微量移液器持针器套件	Applied Scientific Instrumentation	M-Pip
压力注射仪	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
显微操作装置：显微操作器	Narashige (Tritech)	M-152
磁力支架和底板	Tritech	MINJ-HBMB
玻璃针拉制仪	Sutter Instrument	P-97
体视显微镜	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	85300	用于匀浆幼虫样品
材料
琼脂糖	Fisher	BP160-500
氨苄青霉素钠盐	Fisher	AAJ6380706
牛血清白蛋白，第V组分（BSA, fraction V）	VWR	AAJ65855-22
硫酸卡那霉素	Fisher	AAJ1792406
L型涂布棒	Fisher	14 665 230
微毛细玻璃针（无内丝）	World Precision Instruments (WPI)	TW100-3
Microloader 移液器吸头	VWR	89009-310	用于将曲霉菌悬液装入针头
Miracloth 过滤布	VWR	EM475855-1R	用于过滤曲霉菌悬液
N-苯基硫脲	Fisher	AAL0669009	用于防止色素沉积
酚红，1% 溶液	Fisher	57254
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Tricaine）	Fisher	AC118000500	用于麻醉幼虫
吐温-20（Tween-20）	Fisher	BP337-500
培养基与溶液			成分/配方
E3 培养基：60x E3			17.2 g NaCl，0.76 g KCl，2.9 g CaCl₂，4.9 g MgSO₄·7H₂O，加水至 1 L
1x E3			16.7 ml 60x 储液，430 µl 0.05 M NaOH，加水至 1 L（可选：+ 3 ml 0.01% 亚甲蓝）
三卡因储备液			2 g 三卡因，5 g Na₂HPO₄·7H₂O，4.2 ml 60X E3，加水至 500 ml，用 NaOH 调节 pH 至 7.0–7.5
葡萄糖基本培养基（GMM）琼脂：GMM 琼脂			10 g 葡萄糖（右旋糖），50 ml 20x 硝酸盐溶液，1 ml TE，加水至 1 L，用 NaOH 调节 pH 至 6.5，加入 16 g 琼脂，高压灭菌
20x 硝酸盐溶液			120 g NaNO₃，10.4 g KCl，10.4 g MgSO₄·7H₂O，30.4 g KH₂PO₄，加水至 1 L，高压灭菌
微量元素（TE）			2.20 g ZnSO₄·7H₂O，1.10 g H₃BO₃，0.50 g MnCl₂·4H₂O，0.16 g FeSO₄·7H₂O，0.16 g CoCl₂·6H₂O，0.16 g CuSO₄·5H₂O，0.11 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，5.00 g Na₂EDTA，加水至 100 ml，搅拌过夜溶解，高压灭菌