用于探究昆虫蛹期炎症细胞动态的光转化技术

摘要

来源：Weavers, H. 等人， 长期 在体 内 炎症细胞动态的追踪 黑腹果蝇 蛹 视频实验杂志 (2018)

视频展示了利用光转换技术研究炎症细胞动态的方法 果蝇 蛹。绿色的血细胞被吸引至受损的上皮组织，随后发生远距离迁移。光转化使部分血细胞由绿色变为红色，便于追踪其运动。

方案

本方案包含四个主要的连续步骤：（1）准备 果蝇 库存与分阶段处理 果蝇 蛹，（2）蛹的解剖与制片，（3）蛹的创伤处理，（4） 体内 延时共聚焦成像

1. 准备 果蝇 蛹的保存与分级

1. 获取适当的 黑腹果蝇 储备液（参见引言和 材料表).
2. 收集适当基因型的年轻健康成年果蝇。
   1. 使用二氧化碳气体麻醉垫短暂麻醉果蝇，并用细毛刷将具有适当基因型或性别的成年果蝇转移至收集管中。
   2. 向每个含有标准果蝇培养基（玉米粉-糖蜜-琼脂混合物，参见 材料列表添加酵母的）
3. 为获得最佳的蛹代产量，每天将成虫转移至装有新鲜培养基的新试管中，并将所有试管置于25 °C条件下培养。
   注意： 若使用 Gal4-上游激活序列（Gal4-UAS）系统驱动谱系特异性基因表达，则所有步骤均应在 25 °C 或更高温度下进行，因为 Gal4-UAS 系统具有温度敏感性。
4. 在预定成像前18小时，选取至少10只新形成的白色未成熟蛹（图1A) 从样品瓶中（即 在蛹形成后0小时（APF），使用镊子或细毛刷将蛹从原培养瓶内壁上轻轻取下，并小心转移至一个洁净的空塑料培养瓶侧面。
   注意： 游走 3^rd 龄幼虫会从培养基中向上爬行以化蛹；新形成的白色前蛹因其前端气门外翻且静止不动（与3龄幼虫不同）而易于识别^rd 龄幼虫）。表皮会转变为“蛹壳”（即蛹的外壳），最初质地柔软且呈白色。操作时必须小心避免损伤蛹体，因为这不仅可能引发非预期的损伤诱导性炎症反应，还可能导致显著的发育延迟。
5. 将选中的蛹在25 °C下置于试管中培养至适当的发育阶段（羽化后18小时可获得最佳结果）。
   注意： 随着蛹的发育，蛹壳会逐渐变暗并变得更加脆硬。
6. 提前准备好下一步所需的其他试剂。制备庚烷胶时，将一段长约20 cm的卷状双面胶带与20 mL庚烷加入50 mL离心管中，用石蜡膜密封，在室温下于摇床上轻轻振荡过夜。

2. 准备与解剖 果蝇 蛹

1. 将处于特定阶段的Drosophila蛹转移至固定在载玻片上的双面胶带上。使蛹的腹面牢固地粘附在胶带上，背面朝上（图1B）。
   注意： 蛹的前端可通过从蛹壳前端突出的两个气门进行识别。
2. 在明场解剖显微镜下，使用镊子和显微剪小心地将蛹从其保护性的蛹壳中取出（图1B-D）。
   1. 首先，使用镊子在蛹壳最前端区域做一切口（图1B）。确保该区域的蛹壳内部为空腔，不含蛹体组织，因为在早期蛹发育过程中，蛹体会在壳内收缩。
   2. 完成初始切口后，使用镊子或显微剪沿从前向后的方向小心撕开或剪开蛹壳（图1C），直至蛹完全脱离棕色不透明且脆性的外壳（图1D）。
      注意： 此阶段的蛹非常脆弱，操作时需避免刺破蛹体表面；一旦刺破，血淋巴会迅速从穿刺处渗出，易于识别。任何穿刺损伤，无论多小，均应弃用该样本。
3. 使用庚烷胶将蛹固定在玻璃底培养皿中。
   1. 用20 mL移液枪头将10 µL预先配制好的庚烷胶（见上文第1.6节）以细线状滴加在玻璃底培养皿表面。
   2. 待胶液干燥约5秒后，用镊子小心将解剖好的蛹转移至庚烷胶上（图1E）。
   3. 为便于后续损伤处理和成像，建议将蛹排成一行；建议每行放置约5只蛹，但随着经验积累可适当增加数量。
      注意： 当使用正置成像系统时，推荐使用庚烷胶；若使用倒置系统，则非必需。若胶体在成像过程中引起光学畸变，可直接将蛹置于盖玻片上——在大多数情况下，蛹体组织与玻璃之间的自然黏附已足够稳定，前提是移动成像用培养皿时需格外小心。
4. 为获得最佳效果，应将蛹固定成使其翅膀平贴于盖玻片，且大部分翅面与盖玻片直接接触（图1F）。使用镊子轻轻滚动蛹体以调整其位置，确保翅膀正确贴附。
5. 为防止成像期间样本脱水，在完成固定后，于玻璃底培养皿侧边放置一片用蒸馏水浸湿的吸水滤纸，注意不要扰动已固定的蛹（图1E），然后盖上皿盖。
   注意： 此时蛹已准备好进行损伤处理和成像。

3. 激光诱导损伤 果蝇 蛹翅

1. 将装有固定蛹的玻璃底培养皿转移至配备可调谐激光消融系统的宽场显微镜上。
   1. 使用脉冲紫外风冷氮泵浦消融激光器，调谐至 435 nm —— 详见材料表；照明光的确切波长由用户通过合适的染料池进行选择。
2. 使用明场光学系统，调节显微镜载物台控制装置，定位待损伤的第一个蛹的翅芽（图1F）。
3. 为获得最佳效果，在成像和激光消融过程中均使用油浸 40X 或 63X 物镜；确保消融与成像系统之间所用浸油液（油或甘油）保持一致。使用微调焦旋钮调节显微镜，使焦平面聚焦于最靠近玻璃盖玻片的蛹翅上皮层（即 聚焦于将要损伤的上皮区域）。
4. 通过调节显微镜载物台，使蛹翅处于待损伤区域与已知的激光消融靶区完全对齐的位置。
5. 使用安装在显微镜上的能量密度衰减滑片手动调节消融光的功率水平。
   注意： 衰减滑片设有卡位和刻度，用于标识相对衰减水平，并支持使用可重复的设定值。
6. 通过外部手动触发器控制，单次短暂按下触发器启动消融激光以制造伤口。观察消融部位是否出现瞬时气泡，因为通常损伤会伴随气泡产生。使用适当的荧光滤光片观察蛹上皮组织，以确认激光诱导的损伤是否成功。
   注意： 务必避免激光束的意外暴露，因反射光束可能导致严重的眼部或皮肤损伤。
7. 若损伤未成功，可调整焦平面（将显微镜焦点略高于或低于当前焦平面），并再次单次触发消融激光。或者，逐步增加衰减滑片的激光功率，直至达到所需的伤口大小。
8. 如需改变消融激光脉冲重复频率，请使用后部控制面板上的重复频率旋钮（可将频率从每秒不足1个脉冲调节至60 Hz）。为实现最佳损伤效果，将脉冲重复频率设为 40 Hz。
9. 为产生不同大小的伤口，可通过能量密度衰减滑片手动调节消融光的功率水平。
10. 避免对所有固定好的蛹进行损伤操作，保留部分未消融的蛹作为无损伤对照组。
11. 为确保结果一致性，应定期重新校准消融系统（参照相关操作手册）。同时，清洁并重新填充用于控制激光输出波长的染料谐振池。

4. 体内时间序列共聚焦成像

1. 迅速将玻璃底培养皿转移至合适的显微镜，进行延时成像。
   注意：为获得最佳结果，应使用配备高灵敏度探测器的高性能共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜，以同时检测绿色荧光蛋白（GFP）和 mCherry 荧光信号。
2. 为成像整个蛹翅，使用低倍物镜（例如 20X）（图2A）。为高空间分辨率地成像伤口修复过程及伴随的炎症反应，使用油浸 40X（NA 1.3）或 63X（NA 1.4）物镜（参见 图2B-D 中的代表性图像）。
3. 打开与显微镜配套的图像采集软件。
4. 在图像采集软件中，开启适当的激光器，例如 488 nm 和 561 nm 激光器，分别用于可视化 GFP 和 mCherry 荧光信号（通过点击相应选项框），并调节激光功率以及增益/偏移设置，以获得足够强的荧光信号，同时避免像素饱和；使用尽可能低的激光功率（通常在 5 - 20% 范围内），以最小化光漂白和光毒性。
5. 为同时捕获正在修复的上皮组织和炎症细胞的募集过程，通过控制面板上的精细调焦旋钮设置显微镜记录 z 轴层扫图像；为获得最佳效果，通过手动点击软件设置，以每层间隔不超过 3 µm 的步长，从伤口上皮顶部到底部细胞外空间（包含迁移中的血细胞）进行 z 轴扫描，从而构建一个较大的 z 轴堆栈（范围约为 50 - 100 µm）。
6. 进行延时成像时，以固定时间间隔（至少每 30 秒一次）记录 z 轴堆栈，持续至少伤口形成后 1 小时。
   注意： z 轴堆栈之间的具体时间间隔选择需权衡快速变化的细胞动态捕捉需求与避免样品光漂白之间的关系。
7. 为同时成像多个蛹（包括未消融的无伤口对照样本），使用连接至显微镜的电动载物台，并启用成像软件中的多点采集功能。通过载物台位置控制旋钮在软件中手动设定每个蛹的位置，然后为每个样本手动设定合适的 z 轴堆栈范围（顶部和底部边界）。
8. 可在图像采集过程中或之后，使用专业图像分析软件（如 ImageJ）通过 z 轴投影或三维重建方式观察延时图像。例如，为追踪单个血细胞的运动（如 图2C' 和 D' 所示），可使用开源 ImageJ 插件“TrackMate”或“Manual Tracking”追踪血细胞核（方法已发表）。
9. 在成像过程中，使用光转换探针（如 Kaede）选择性地进行光转换并标记部分上皮细胞或免疫细胞。
   1. 在成像软件中打开相应的模块以执行光转换操作（如光漂白后荧光恢复（FRAP）模块），并激活 405 nm 激光器（通过点击软件中相应选项框）。
   2. 在 FRAP 软件中使用方形、圆形或自由选择工具选定需进行光转换的细胞。在 FRAP 软件中，将光转换（漂白）的时间过程设置为单次迭代/帧，并将 405 nm 激光器功率设为 20%。手动点击 开始实验 以执行光转换。
   3. 退出 FRAP 模块（点击 关闭），返回软件中的原始成像界面；使用 488 nm 和 561 nm 激光器，按照上述方法设置 z 轴堆栈和延时记录，以观察已光转换和未光转换细胞的行为。
      注意： 光转换探针在初始光转换后可保持稳定数小时，从而能够长时间追踪光转换细胞的行为（至少 5 小时）。例如，可选择性地对伤口处的炎症细胞进行光转换（图2F），并追踪其从损伤部位消退的过程（图2G 和 H）。

结果

图1：Drosophila 蛹用于损伤与活体成像的制备。（A）在0小时APF收集的Drosophila 白色前蛹，前端由外翻的呼吸附属结构（气管）指示。（B）将0小时APF的白色前蛹在25 °C下培养18小时后，蛹壳呈棕色。解剖应从前端最突出的区域（箭头）开始，此处由外翻的气管指示，因该区域无真正的蛹体，使用精细镊子和/或显微剪刀去除保护性蛹壳（C）。蛹翅将可见于蛹胸部的两侧（蓝色轮廓）。（D）从18小时APF的蛹中完全去除蛹壳，此处蛹体已旋转90°以显示侧面，待成像的翅区以蓝色标出。（<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇品系
泛素启动子驱动的GFP标记E-钙黏蛋白；Ubi-p63E-shg.GFP；（第II染色体）	京都 stock 中心，DGRC	#109007	Ubi-p63E 启动子序列驱动表达 黑腹果蝇 C末端用GFP标记的E-cadherin（枪法转染）。
泛素启动子驱动的GFP标记E-钙黏蛋白;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)	布卢明顿 黑腹果蝇 印第安纳大学库存中心	#58742	Ubi-p63E 启动子序列驱动表达 果蝇 C末端用GFP标记的E-cadherin（枪法转染）
普遍表达的GFP标记Moesin P{sGMCA}3.1	布卢明顿 果蝇 印第安纳大学保藏中心	#59023	广泛表达的 sqh 启动子/增强子驱动一段包含肌动蛋白结合序列的Moesin片段的表达，该片段与GFPS65T融合。
血细胞特异性Serpent-Gal4驱动子；srp-Gal4	由 Katja Bruckner 生成	由 Katja Bruckner 生成	由上游两个基因组序列调控的带有polyA尾的Scer\GAL4表达 果蝇 serpent。参考文献：Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. PDGF/VEGF受体调控黑腹果蝇中的血细胞存活。Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004)。
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6	布卢明顿 黑腹果蝇 印第安纳大学库存中心	#8545 或 #8547	UAS 调控序列驱动 RFP 的 DsRed.T4 形式表达，该形式在 C 末端带有核定位信号标签
UAS-细胞质GFP ;;P{UAS-GFP.S65T}	布卢明顿 果蝇 库存中心（印第安纳大学）	多种品系可选（例如 #1522）	通过UAS调控序列表达GFP的S65T突变体；该S65T突变体表现出增强的荧光亮度。
UAS-光可转换Kaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	布卢明顿 果蝇 印第安纳大学品系中心	#26161	Kaede蛋白在合成后发出明亮的绿色荧光，但在紫外光照射下可高效转变为明亮且稳定的红色荧光。
GFP 标记的意大利面南瓜 w1118;;P{sqh-GFP.RLC}	布卢明顿 黑腹果蝇 印第安纳大学库存中心	#57145	在天然 sqh 启动子的调控下，sqh 编码区在C末端被标记有 T:Avic\GFPS65T 标签并表达。
果蝇食物培养基成分			果蝇食物培养基的制备按照标准流程进行（参见 Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of 黑腹果蝇 遗传学。冷泉港出版社。第1-191页。
玉米	英国布里斯托尔 Wild Oats 公司（或同等供应商）	直接联系供应商	有机的
大豆粉	野生燕麦，英国布里斯托（或同等供应商）	直接联系供应商	有机的
麦芽提取物	野生燕麦，英国布里斯托（或同等供应商）	直接联系供应商	有机的
糖蜜	英国布里斯托尔Wild Oats公司（或同等供应商）	直接联系供应商	有机的
Difco 琼脂	BD 生物科学，Fisher 科学	DF0142-15-2	用于果蝇食物的制备
丙酸	Sigma	402907	果蝇食物的制备
尼泊金酯	Sigma	79721	用于果蝇食物的制备
干酵母粉	Redstar，Dutscher Scientific，英国有限公司	Redstar，Dutscher Scientific，英国有限公司	果蝇食物制备
样品制备与封片
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	用于制备庚烷胶
细毛貂毛画笔	Daler-Rowney（或同等产品）	#0 或 1
镊子	Fisher Scientific（或 Fine Science Tools）	NC9404145	Dumont #5
用于成像的玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C	建议使用35 mm的培养皿，其微孔深度至少为10 mm，盖玻片厚度为0.085–0.13 mm，未包被。使用微孔更大的培养皿可在单次实验中固定和成像更多数量的蛹。
庚烷	Sigma	51730-5ML	用于制备庚烷胶水
双面胶带（例如 Scotch）	Agar Scientific	AGG263	用于制备庚烷胶
50 ml 离心管（用于正庚烷胶）	Fisher Scientific 公司的 Falcon 管	14-432-22	用于制备庚烷胶
玻璃显微镜载玻片	Agar Scientific	AGL4244	果蝇蛹的解剖
带有明场的解剖立体显微镜	徕卡（或同等品牌）	M50	果蝇蛹的解剖
显微剪刀	约翰·韦斯国际公司	103123	微型研究剪刀（直型）
激光消融与成像
氮气消融激光	光谱物理（或 Andor 等效产品）	Model VSL-337ND-S	用于损伤实验时，应将其连接至宽场成像系统
多激光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）	徕卡（或同等产品）	TCS AOBS SP8 或 SP5-II，连接至 Leica DMi8 倒置落射荧光显微镜（或同等设备）	理想情况下应配备电动载物台，用于多点位和“镶嵌”式扫描，以及“混合型”GaAsP检测器（可显著提高灵敏度并增强弱信号）。
环境舱	Life Imaging Services（或同等产品）	"显微镜温度控制系统"	连接至共聚焦显微镜以在成像期间控制温度
图像分析软件
FRAP 软件模块	徕卡（或同等产品）	共聚焦激光扫描显微镜 FRAP 软件模块	用于进行光可转换荧光蛋白（如 Kaede）的光转换
ImageJ（图像分析软件）	美国国立卫生研究院（NIH）	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A.，Rasband, W.S.，Eliceiri, K.W. "从 NIH Image 到 ImageJ：25 年的图像分析历程". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ 插件 "手动追踪"	美国国立卫生研究院（NIH）	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ 插件 "TrackMate"	ImageJ，美国国立卫生研究院（NIH）	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. 等人 (2016)， "TrackMate：一个开放且可扩展的单粒子追踪平台"，方法 115：80-90，PMID 27713081
Volocity（高性能三维成像软件）	Perkin Elmer	Volocity 6.3	用于图像分析
IMARIS（图像分析软件）	Bitplane	IMARIS 在细胞生物学研究中的应用	用于图像分析