探索昆虫蛹炎症细胞动力学的光转化技术

Abstract

来源:Weavers， H. et al.， 果蝇蛹内炎症细胞动力学的长期体内追踪。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频演示了使用光转化来研究果蝇蛹中的炎性细胞动力学。绿色血细胞被吸引到受伤的上皮细胞，然后进行远距离迁移。光转化使某些血细胞从绿色变为红色，从而促进它们的运动跟踪。

Protocol

该协议包括四个主要的连续步骤:（1） 果蝇库存的准备和果蝇蛹的分期，（2） 蛹解剖和安装，（3） 蛹伤口，（4） 体内延时共聚焦成像。

1. 果蝇种群的制备和蛹的分期

1. 获得适当的果蝇原液（参见简介和材料表）。
2. 收集适当基因型的年轻健康成年果蝇。
   1. 通过使用二氧化碳气垫短暂麻醉果蝇，并使用细画笔将适当基因型或性别的果蝇转移到收集瓶中，从而选择成年果蝇。
   2. 向每个小瓶中加入 20 只原始雌性和 20 只雄性，这些小瓶中含有补充有酵母的标准苍蝇食品培养基（玉米面-糖蜜-琼脂混合物，参见材料表）。
3. 为了获得最佳的蛹生成，每天将成蝇倒在新鲜小瓶中的新食物上，将所有小瓶保持在 25 °C.
   注意:如果使用 Gal4 上游激活序列 （Gal4-UAS） 系统来驱动谱系特异性基因表达，则所有步骤都应在 25 °C 或更高温度下进行，因为 Gal4-UAS 系统对温度敏感。
4. 在预定的成像会话前 18 小时，使用镊子或细画笔从小瓶中选择至少 10 个新形成的白色前蛹（即蛹形成后 0 小时，APF），将蛹从小瓶内部表面移出，并小心地将蛹转移到干净的空塑料瓶的侧面。
   注意:游荡的 3^龄幼虫从食物培养基中向上爬行，进行化蛹;新形成的白色前蛹很容易识别，因为它们具有外翻的前气孔并且是静止的（与 3^龄幼虫不同）。角质层转变为 "蛹"（蛹壳），最初是柔软的白色的。必须注意避免损坏蛹，因为这不仅会导致不必要的损伤引起的炎症反应，还会导致显着的发育延迟。
5. 将选定的蛹在 25 °C 的小瓶中陈化至适当的发育阶段（18 小时 APF 将产生最佳结果><）。 注意:随着蛹的发育，蛹壳会逐渐变得更黑、更脆。
6. 提前为下一步准备其他试剂。要制作庚烷胶，请将 20 cm 长的卷起双面胶带与 20 mL 庚烷混合在 50 mL 离心管中，用石蜡膜密封，并在室温下在工作台上摇动过夜。

2. 果蝇蛹的制备和解剖

1. 将暂存的果蝇蛹转移到安装在载玻片上的一张双面胶带上。放置蛹，使腹侧牢牢地粘在胶带上，背侧朝上（图 1B><）。 注意:蛹的前部可以从从蛹壳前端突出的两个气孔中识别出来。
2. 在明场解剖显微镜下，使用镊子和微型剪刀小心地从其保护性蛹壳中取出蛹（图 1B-D）。
   1. 最初，使用镊子在蛹的最前部区域做一个切口（图 1B）。确保该区域的蛹壳是空心的并且没有蛹组织，因为在蛹的早期发育过程中，蛹会在壳内收缩。
   2. 在这个初始切口之后，使用镊子或微型剪刀小心地从前到后撕开或切开蛹壳（图 1C），直到蛹完全摆脱棕色不透明脆壳（图 1D><）。 注意:这个阶段的蛹非常脆弱，必须小心避免刺穿蛹表面;穿刺很明显，因为血淋巴液会迅速从穿刺部位渗出。有穿孔的蛹，无论多么小，都应该丢弃。
3. 使用庚烷胶将蛹安装在玻璃底培养皿中。
   1. 使用 20 mL 移液器吸头将 10 mL 预先准备好的庚烷胶（参见上文第 1.6 节）滴在玻璃底培养皿上排成一行。
   2. 让胶水干燥 5 秒，然后使用镊子将解剖的蛹小心地转移到庚烷胶上（图 1E）。
   3. 为了便于受伤和成像，将蛹排成一排;建议大约 5 只蛹，但根据经验可以控制更多。
      注意:使用正置成像系统时，建议使用庚烷胶，但在使用倒置系统时不是必需的。如果胶水在成像过程中产生光学像差，则可以将蛹直接放在盖玻片上——在大多数情况下，蛹组织和玻璃之间的自然粘附就足以实现稳定的成像，只要在显微镜之间移动成像皿时要小心。
4. 为获得最佳效果，安装蛹，使机翼平放在盖玻片上，机翼表面的大部分与盖玻片直接接触（图 1F）。用镊子滚动蛹以改变它们的位置，以确保翅膀正确安装。
5. 为防止样品在成像期间脱水，在安装结束时，在玻璃底培养皿的侧面添加一张浸泡在蒸馏水中的吸收性滤纸，注意不要打扰蛹（图 1E）。盖上盖子。
   注意:蛹现在已经准备好进行受伤和成像。

3. 激光诱导的果蝇蛹翼损伤

1. 将装有已安装的蛹的玻璃底培养皿转移到配备有可调谐激光消融系统的宽视场显微镜中。
   1. 使用调谐到 435 nm 的脉冲紫外风冷氮泵烧蚀激光器 - 有关详细信息，请参阅材料表;用于照明的光的精确波长由用户通过适当的染料池选择。
2. 使用明场光学元件，调整显微镜载物台控制以定位第一个要受伤的蛹的蛹翼（图 1F）。
3. 为获得最佳效果，使用油浸 40 倍或 63 倍物镜进行成像和激光消融;确保使用的浸没液（油或甘油）在消融和成像系统之间保持一致。使用微调控制旋钮调整显微镜，使其聚焦在最靠近玻璃盖玻片的蛹翼上皮平面上（即聚焦在要受伤的上皮区域）。
4. 使用显微镜载物台调整，定位蛹翼，使要受伤的区域与消融激光器的已知目标区域直接对齐。
5. 使用安装在显微镜上的能量密度衰减器载玻片手动调整消融灯的功率水平。
   注意:衰减器滑块具有咔嗒声停止和标尺，用于识别衰减的相对级别并允许使用可重现的设置。
6. 使用外部手动触发控制，只需短暂点击触发器即可激活消融激光以形成伤口。检查消融部位是否有瞬时气泡，因为伤口通常会伴有气泡。使用适当的荧光滤光片检查激光诱导的伤口是否成功，以观察蛹上皮。
   注意:注意避免意外暴露在激光束下，因为光束反射会导致严重的眼睛或皮肤损伤。
7. 如果受伤不成功，请改变焦平面（将显微镜焦点移动到当前焦距水平略高于或下方）并重复单击消融触发器。或者，使用衰减器载玻片逐渐增加激光功率，直到达到所需的伤口尺寸。
8. 要改变烧蚀激光脉冲重复率，请使用后控制面板上的重复率旋钮（将频率从小于 1 脉冲/秒更改为 60 Hz）。为了达到最佳伤害效果，请将脉冲重复频率设置为 40 Hz。
9. 要生成不同大小的伤口，请使用能量密度衰减器滑块手动调整消融灯的功率水平。
10. 避免伤害所有已装蛹，并将这些未消融的蛹用作未受伤的对照。
11. 为了获得一致的结果，请定期重新调整消融系统（使用相关的作手册）。此外，清洁并重新填充控制激光输出波长的染料谐振器电池。

4. 体内延时共聚焦成像

1. 将玻璃底培养皿快速转移到合适的显微镜上进行延时成像。
   注意:为获得最佳结果，请使用配备灵敏检测器的高规格共聚焦或转盘显微镜，该检测器可检测绿色荧光蛋白 （GFP） 和 mCherry 荧光基团。
2. 要对整个蛹翼进行成像，请使用低放大倍率（例如 20X）物镜（图 2A）。要以高空间分辨率对伤口修复和伴随的炎症反应进行成像，请使用油浸 40X （NA 1.3） 或 63X （NA 1.4） 物镜（参见图 2B-D 中的代表性图像）。
3. 打开与显微镜关联的相应图像捕获软件。
4. 使用图像捕获软件，打开适当的激光器，例如 488 nm 和 561 nm 激光器，分别可视化 GFP 和 mCherry 荧光团（通过单击相关框）并调整激光功率和增益/偏移设置以提供足够的荧光信号，同时避免像素饱和;使用尽可能低的激光功率（在 5 - 20% 范围内）以最大限度地减少光漂白和光毒性。
5. 为了捕获修复上皮细胞和炎性细胞募集，使用控制面板上的微调旋钮将显微镜设置为记录 z 堆栈;为获得最佳结果，将软件（使用手动按钮单击）设置为通过蛹翼（至少每 3 毫米）记录 z 切片，从受伤的上皮顶部到下面的细胞外空间（包含迁移的血细胞）以实现大的 z 堆栈（在 50 - 100 的范围内毫米）。
6. 对于延时成像，在受伤后至少 1 小时内以固定的时间间隔（至少每 30 秒）记录 z 堆栈。
   注意:所选 z 堆栈之间的确切时间间隔代表了捕获快速变化的细胞动力学和避免样品光漂白之间的权衡。
7. 要同时对多个蛹（包括未消融的未缠绕对照）进行成像，请使用电动载物台（连接到显微镜）和成像软件中提供的多位置采集功能。使用载物台位置控制旋钮在软件中手动设置每个蛹的位置，然后为每个蛹手动设置适当的 z 堆栈限制（顶部和底部）。
8. 在图像捕获期间或之后使用专业图像分析软件（如 ImageJ）使用 z 堆栈投影或 3D 渲染可视化延时图像。例如，要跟踪单个血细胞的运动（如图 2C' 和 D'），请使用开放访问 ImageJ 插件"TrackMate"或"手动跟踪"（方法发布在中）跟踪血细胞核。
9. 在成像过程中，使用光转化探针（如 Kaede）选择性地进行光转化并标记上皮细胞或免疫细胞的子集。
   1. 在成像软件中打开适当的模块以执行光转换（例如光漂白后的荧光恢复 （FRAP） 和光漂白后的荧光恢复模块）并激活 405nm 激光器（通过单击相关软件框）。
   2. 使用方形、圆形或手绘选择工具在 FRAP 软件中选择要进行光转换的单元格。在 FRAP 软件中，将光转化（漂白）的时间进程设置为单次迭代/帧，并将 405 nm 激光器设置为 20% 激光功率。手动单击 Start the experiment 以执行光转换。
   3. 退出 FRAP 模块（单击"关闭"）并返回到软件中的原始成像屏幕;使用 488 nm 和 561 nm 激光器通过如上所述设置 z 堆栈和延时记录来对光转化和非光转化细胞的行为进行成像。
      注意:光转化探针在初始光转化后数小时内保持稳定，从而能够随着时间的推移（至少 5 小时）跟踪光转化细胞的行为。例如，伤口中的炎症细胞可以选择性地进行光转化（图 2F），并在它们从受伤部位消退时跟踪它们的行为（图 2G 和 H）。

Results

图 1:用于伤口和实时成像的果蝇蛹制剂。（A） 在 0 小时 APF 收集的果蝇白色前蛹，前端由外翻的呼吸附件（气孔）表示。（B） 在 25 °C 下将白色 0h APF 前蛹培养 18 小时后，蛹呈棕色。蛹壳的解剖应从最前面的区域（箭头）开始，由外翻的气孔表示，因为该区域没有蛹，并使用细镊子和/或微剪刀去除保护性蛹壳 （C）。蛹翼将在蛹胸部的侧面可见（蓝色轮廓）。（D） 从 18h APF 蛹中完全去除蛹壳，此处蛹已滚动 90° 以显示侧面，翅膀以蓝色轮廓成像。（E-F）使用庚烷胶将 5 个 18 小时 APF 蛹安装在成像皿内的玻璃盖玻片上，并用浸水滤纸减少脱水 （E

Materials