一种用于评估抗荚膜抗体对荚膜细菌调理作用的调理-黏附检测法

摘要

来源：Chua, J., 等 用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体。 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了一种调理-黏附试验，用于研究经调理的细菌与免疫细胞之间的相互作用。将用含抗荚膜抗体的待测血清处理过的荧光标记细菌与巨噬细胞共同孵育。在对巨噬细胞进行荧光染色后，通过显微镜观察附着在巨噬细胞表面的细菌，以实现可视化检测。

方案

1. 细菌培养与制备

注意：本方案中使用的细菌种类为具有荚膜的高毒力菌株B. anthracis Ames。对该菌株的所有操作均需具备相应的生物安全和安保许可，并且必须在位于BSL-3实验室内的II级或III级生物安全柜中进行。操作细菌时，须遵循机构规定的BSL-3实验操作规程以及个人防护装备使用规范。

1. 通过将 37 g 脑心浸液（BHI）粉末溶解于 1 L 水中，并在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，制备脑心浸液（BHI）肉汤。将肉汤储存在室温下。
2. 用水配制 8% 碳酸氢钠溶液，并使用 0.20 µm 滤器注射器过滤除菌。将溶液储存在 4 °C 下，并在 1 天内使用。
3. 将 8 g 营养肉汤、3 g 酵母提取物和 15 g 琼脂加入 1 L 水中，制备 NBY 琼脂平板。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，倒入培养皿中，待其凝固。将平板储存在 4 °C 下。
   注意： NBY 琼脂平板可添加或不添加碳酸氢钠。在液体和固体培养基中添加碳酸氢钠可诱导黏液型菌落生长，这些菌落由有荚膜的杆菌组成。液体和固体培养基中碳酸氢钠的终浓度均为 0.8%。
4. 通过混合 50% 高压灭菌的 BHI 肉汤、40% 胎牛血清（FBS）和 10% 碳酸氢钠溶液（v/v），制备炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）的培养肉汤。
   注意： 该肉汤配方旨在产生短链的有荚膜杆菌。
5. 在肉汤培养前一天，从芽孢储备液中划线接种 NBY 琼脂平板以分离单菌落，制备炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）的主培养平板。在 37 °C 下孵育。
6. 在通气的 250 mL 三角瓶中加入 30 mL 培养肉汤，并接种数个炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）菌落。
   注意： 为获得最大程度荚膜化的杆菌，需使用此处指定的液体体积与表面积比例。
7. 在 125 rpm 转速、37 °C、20% CO₂ 及湿度条件下振荡培养肉汤 18–24 小时。
   注意： 在高于 37 °C 的温度下培养炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）可能会抑制荚膜生成。
8. 在固定前，使用印度墨水负染色法确认荚膜形成充分，且杆菌呈短链排列（每链 1–5 个杆菌）（见第 2 节）。
9. 为测定菌落形成单位（CFU），取 100 µL 培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）进行 1:10 系列稀释，将稀释液涂布于绵羊血琼脂平板。在 37 °C 下孵育 12–18 小时。计数 CFU 并确定每毫升培养物中的细菌数量。
   注意： 细菌固定后也可在显微镜下使用血球计数板进行计数。但不推荐此方法，因为在低倍镜下难以观察到杆菌。
10. 向全部体积的细菌培养物中加入 16% 多聚甲醛（PF），使终浓度为 4% PF，以固定杆菌。在室温下缓慢振荡孵育 7 天。
    注意： 7 天 4% 多聚甲醛固定程序基于美国传染病医学研究机构（USAMRIID）关于固定营养态杆菌的标准操作规程。
11. 为去除固定剂并检测无菌性，将 4 mL（10% 体积）固定后的细菌悬液置于 50 mL 锥形管中，用 PBS 每次 30 mL 洗涤三次，每次在 ≥3000 x g 条件下离心 45 分钟。将剩余样品储存在含 4% 多聚甲醛的溶液中，置于 4 °C。
    注意： 由于存在荚膜，细菌沉淀在离心后呈蓬松状。洗涤过程中应小心避免扰动沉淀。必须彻底去除所有固定剂，以免干扰后续的活力检测。如有必要，可增加洗涤次数。
12. 进行活力检测时，取 4 mL 洗涤后的细菌悬液接种至 40 mL 细菌培养基（如 BHI 肉汤）中（接种量 ≤ 肉汤体积的 10%），在 37 °C 下孵育 7 天。分别在孵育前后测定 600 nm 处的光密度以评估浊度变化。
13. 肉汤培养孵育 7 天后，取 ≥100 µL 肉汤涂布于琼脂平板，再继续孵育 7 天。若未观察到浊度增加且平板上无菌落生长，则认为原始培养物已无菌，可转移至 BSL-2 实验室。
    注意： 根据美国联邦选择性病原体项目规定，灭活的炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）仅可在证明样品完全无菌后，从 BSL-3 实验室转移。对灭活炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）的活力检测包括：将样品的 10% 接种于肉汤中培养 7 天，随后转接至固体培养基再培养 7 天。在确认无菌后，应遵循所在机构的规程申请转移许可。         

2. 负染色法与光学显微镜观察荚膜及杆菌链

1. 在载玻片上将5 µL细菌悬液与2 µL印度墨水混合。将厚度为1或1.5 µm的盖玻片覆盖在悬液上，避免产生气泡。
   注意：可使用指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。
2. 使用光学显微镜的40x至100x油镜观察细菌悬液。通过观察每个细菌周围是否存在透明区（荚膜排斥印度墨水形成的空白区域）来确认细菌是否具有荚膜，并确认杆菌呈短链排列。

3. 细菌的FITC标记

1. 将异硫氰酸荧光素（FITC）溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为 2 mg/mL 的溶液。
2. 测量灭活细菌储备液的体积。
3. 用 PBS 洗涤该储备液 3 次，以去除固定剂。
4. 加入 FITC 溶液，使其终浓度为 75 µg/mL。在 4 °C 下缓慢振荡混合物 18–24 小时。
5. 通过在 ≥3000 x g 条件下离心 45 分钟，使用 30 mL PBS/次进行洗涤，重复 3 次，以去除多余的 FITC。洗涤过程中应确保疏松的沉淀不受扰动。将细菌重新悬浮于与初始体积相同的 PBS 中。
6. 将细菌分装至微量管中，于 -20 °C 保存备用。避免反复冻融细菌，以免细菌荚膜丢失。

4. 细菌调理作用

1. 将少量待测血清（来自非人灵长类动物，NHPs）置于加热块中，56 °C 加热灭活 30 分钟。
2. 将 FITC 标记的细菌解冻，并用 PBS 洗涤两次，每次在 15000 ×g 离心 3–5 分钟。然后用与初始体积相同的 PBS 重悬细菌。
3. 在 96 孔圆底板（板 #2）中，用细胞培养基对待测血清进行系列稀释。在另一块 96 孔圆底板（板 #3）中，向每个孔加入 10 µL 稀释后的待测血清。
   注意： 每块板中均以 PBS 和正常猴血清替代稀释后的待测血清作为阴性对照。我们还选择一份待测血清作为阳性对照，用于生成标准曲线，以标准化不同日期进行的所有实验。该阳性对照血清为任意选定，因其来源充足。
4. 向板 #3 中每孔加入 10 µL 新近重悬的幼兔补体。
   注意： 重悬后，剩余的幼兔补体应丢弃，不得再次冻融。
5. 向板 #3 中加入适量的 FITC 标记杆菌，使感染复数为 1:20。例如，若细胞数量为 5 × 10⁴，则加入含有 5 × 10⁴ × 20 条杆菌的相应体积。再向板 #3 每孔中加入适量细胞培养基，使总体积达到 105 µL。
   注意： 含细胞的板 #1 每孔加入 100 µL 调理过的细菌，剩余 5 µL 为空白体积。每份待测血清的每个稀释度均设两个复孔。
6. 将板 #3 在 37 °C、5% CO₂ 及湿度条件下孵育 30 分钟，以完成杆菌的调理作用。

5. 哺乳动物细胞黏附实验与荧光标记

1. 使用前将所有试剂保持在 37 °C。
2. 将含有贴壁细胞的 1 号板置于 37 °C 加热块上。
3. 使用多通道移液器从孔中移除废弃培养基，并迅速加入来自 3 号板的 100 µL 包被细菌。移液过程中确保孔内无气泡产生。将 1 号板在 37 °C、5% CO₂ 及湿度条件下孵育 30 分钟，以促进细菌黏附。
4. 在 37 °C 加热块上，用 150 µL PBS 每孔洗涤 5 次，以去除未黏附的杆菌。
   注意：洗涤过程中需小心操作，避免细胞意外脱落。
5. 用 PBS 将 16% PF 按 1:4 比例稀释，配制为 4% PF。每孔加入 150 µL 4% PF，固定细胞 1 小时。随后用 PBS 洗涤细胞 2 次。
6. 将 2 µL HCS（高内涵筛选）Orange 细胞染料溶于 10 mL PBS 中混匀。每孔加入 150 µL 染色液，室温孵育 30 分钟。
7. 用 PBS 洗涤孔板 2 次。
8. 染色后于 4 °C 避光保存，直至显微镜观察。

6. 显微镜检查

注意：通常情况下，高通量自动化荧光显微镜有助于OAA的成像。若无自动化系统，可手动拍摄贴壁杆菌的荧光图像。在本研究中，使用配备专用设备的蔡司700激光扫描显微系统对贴壁杆菌和细胞单层进行成像；我们的系统由配备自动载物台、定焦模块（Definite Focus）、40倍数值孔径0.6物镜、Axio Cam HRc相机和Zen 2012（蓝版）软件的蔡司Axio Observer Z1倒置显微镜组成。所获取的图像为宽场图像，而非共聚焦图像。以下方案旨在提供一种适用于多种自动化显微镜系统的基本显微镜设置。

1. 将1号培养板在室温下孵育30分钟。开启显微镜及相关设备。
   注意：在室温下平衡可防止成像过程中玻璃板上产生冷凝水，同时避免因温度变化导致的失焦。
2. 将培养板放置于载物台上，使用明场或相差模式对细胞进行聚焦。
3. 选择96孔板格式作为培养板设置。选择通道参数。
   注意：FITC的最大激发和发射波长分别为495 nm和519 nm；HCS橙色细胞染料的对应波长为556 nm和572 nm。可根据显微镜配备的滤光片选择其他荧光染料。
4. 将采集模式设置为“拼接”（Tile）模式，并设定需采集的图像数量。
   注意：拼接功能可实现对样本孔中多个位置的成像，可设置为按拼接或随机模式采集图像。本实验中每孔采集10个随机区域。
5. 将采集模式更改为“黑白”或“单色”模式，并设置像素合并（binning）≥ 2×2。
   注意：将像素合并从1×1调整为2×2或4×4可提高显微镜成像速度，但会降低图像分辨率。对于OAA实验，此设置已足够，因为该检测需同时计数巨噬细胞和黏附的细菌。
6. 开启自动对焦或对焦模块，并设定自动对焦的频率。如设备支持，开启Z轴层扫（Z stack）功能，并设定Z轴层数，以完整覆盖细胞单层及黏附杆菌的厚度。
   注意：增加Z轴层数会延长显微成像时间，但可确保在每个Z轴位置均获得正确对焦的图像。
7. 指定用于保存图像的文件夹，运行自动成像程序。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.20 µm 注射器滤器（25 mm，再生纤维素）	康宁，纽约州，美国	431222
10 mL 注射器（鲁尔锁扣头）	BD，美国新泽西州富兰克林湖	302995
15µ 96孔黑色板（成像用板#1）	In Vitro Scientific，加利福尼亚州森尼韦尔	P96-1-N
16% 甲醛	电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德	15710
75 cm² 组织培养处理过的培养瓶	康宁，纽约州，康宁	430641
琼脂（粉末）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市	A1296
幼兔补体	Cedarlane Labs，北卡罗来纳州伯灵顿	CL3441
酵母提取物	BD，Sparks，MD	288620
BBL 脑心浸液（BHI）	BD，Sparks，MD	211059
血琼脂（含绵羊血的TSA）平板	Remel，Lenexa，KS	R01198
细胞刮刀	Sarstedt，牛顿，北卡罗来纳州	83.183
Costar 96 孔细胞培养板（板 #2 & 3 用于稀释）	康宁，纽约州，康宁市	3596
盖玻片	电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德	72200-10
Difco 营养肉汤	BD，Sparks，MD	234000
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM），高糖	Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	11965-092	含 4500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、酚红
EVOS FL Auto 细胞成像系统（荧光显微镜）	Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AMAFD1000
胎牛血清	Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根	SH30071.03	未经γ射线照射，未经热灭活
异硫氰酸荧光素	Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	F143
HCS Cell Mask Orange 细胞染料	Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	H32713
血细胞计数板（改进型纽鲍尔）	Hausser Scientific，宾夕法尼亚州霍舍姆	3900
印度墨水溶液	BD，Sparks，医学博士	261194
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham MA	25030081	在培养基中补充额外的 2 mM L-谷氨酰胺
尼康Eclipse TE2000-U（倒置复合显微镜）	尼康仪器公司，梅尔维尔，纽约州	TE2000
不含钙和镁的 PBS	Lonza，美国马里兰州沃克维尔	17-516F
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液	Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根	SV30010
培养皿（100 × 15 mm）	Falcon，Corning，达勒姆，北卡罗来纳州	351029	用于琼脂平板
RAW 264.7 巨噬细胞系（Tib47）	ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC TIB-71
载玻片	VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州	16004-422
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	S5761
台盼蓝溶液（0.4%）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T8154
蔡司700激光扫描显微镜（共聚焦显微镜）	卡尔·蔡司显微成像公司，美国纽约州桑伍德	4.109E+15