利用光激活型肽-MHC评估T细胞的可控激活

摘要

来源：Sanchez, E., 等. 利用光激活激动剂实现T细胞活化的空间与时间控制。J. Vis. Exp. (134), (2018)

本视频演示了一种利用紫外照射去笼化光可激活肽-主要组织相容性复合物的方法。去笼化过程暴露了天然肽序列，从而实现T细胞的精确激活。

方案

1. 刺激性玻璃表面的制备

1. 用去离子蒸馏水（ddH₂O）将生物素化聚-L-赖氨酸（Bio-PLL）按1:500比例稀释后，包被八孔腔室盖玻片₂O）。室温（RT）孵育30分钟。
2. 用 H 洗涤₂O.
3. 室温下干燥2小时。
4. 用封闭缓冲液（HEPES缓冲盐水 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl]，含2% BSA）在室温下封闭Bio-PLL包被的表面，孵育30分钟。
   1. 将5 mg聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶解于1 mL pH 8.5的10 mM NaPO4溶液中。
   2. 加入125 μmol（0.55 mg）NHS-生物素（溶于DMSO的100 mg/mL储备液），并检测反应液pH值。若pH低于8.5，加入2 μL 4 N NaOH将pH调至8.5–9.5之间。
   3. 涡旋 30 分钟。
   4. 用 50 μL 溶于 20 mM Tris（pH 8.0）中的 100 mM 甘氨酸终止反应。
   5. 以最大速度离心10分钟，将上清液转移至新管中。
      ​注意： 生物素化聚赖氨酸（Bio-PLL）的质量通常通过将其连续两倍稀释后包被到96孔ELISA板上，再与碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素孵育，定量生物素含量，以此与先前制备的样....

结果

图1：用于光激活与全内反射荧光成像的显微镜配置。

488 nm 和 561 nm 激光分别用于绿色和红色探针的全内反射荧光（TIRF）和落射荧光成像。光激活所需的紫外光来自一个连接了数字光圈系统的汞（Hg）灯，该系统能够照射用户自定义的小区域。来自汞灯/光圈的光线由位于二向色镜下方的长通反射镜反射至样品上，该二向色镜用于反射成像激光。该二向色镜必须设计为可透过紫外光。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc Lab-Tek 带孔盖玻片	Thermofischer Scientific	155361
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P2636	需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
EZ-Link NHS-生物素	Thermofischer Scientific	20217	需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
链霉亲和素	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500：BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒	Avidity	BirA500	用于蛋白质的生物素标记
生物素化 Hb I-EK			关于蛋白质折叠，请参见参考文献6；关于生物素化，请使用 BirA 试剂盒
生物素化 NPE-MCC I-EK	Anaspec		可从 Anaspec 定制购买 NPE-MCC（HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH）
生物素化 αH2-Kk 抗体	BD Biosciences	553591
生物素化 NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		可从 Anaspec 定制购买 NPE-OVA（H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH）
生物素化 KAVY H2-Db	Anaspec		可从 Anaspec 定制合成蛋白质（KAVYDFATL）
生物素化 ICAM1			关于蛋白质折叠，请参见实验方案中的参考文献；关于生物素化，请使用 BirA 试剂盒
手持式紫外灯	UVP	UVGL-25	灯距离样品 < 1 cm。365 nm 光照 30 秒足以实现可检测的脱笼，20 分钟可实现定量脱笼。
Olympus IX-81 OMAC TIRF 系统	Olympus		有关成像系统的更多信息，请参见图6
Mosaic 数字光阑	Andor
Slidebook 软件	Intelligent Imaging Innovations