利用光激活型肽-MHC评估T细胞的可控激活

摘要

来源：Sanchez, E., 等. 利用光激活激动剂实现T细胞活化的空间与时间控制。J. Vis. Exp. (134), (2018)

本视频演示了一种利用紫外照射去笼化光可激活肽-主要组织相容性复合物的方法。去笼化过程暴露了天然肽序列，从而实现T细胞的精确激活。

方案

1. 刺激性玻璃表面的制备

1. 用去离子蒸馏水（ddH₂O）将生物素化聚-L-赖氨酸（Bio-PLL）按1:500比例稀释后，包被八孔腔室盖玻片₂O）。室温（RT）孵育30分钟。
2. 用 H 洗涤₂O.
3. 室温下干燥2小时。
4. 用封闭缓冲液（HEPES缓冲盐水 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl]，含2% BSA）在室温下封闭Bio-PLL包被的表面，孵育30分钟。
   1. 将5 mg聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶解于1 mL pH 8.5的10 mM NaPO4溶液中。
   2. 加入125 μmol（0.55 mg）NHS-生物素（溶于DMSO的100 mg/mL储备液），并检测反应液pH值。若pH低于8.5，加入2 μL 4 N NaOH将pH调至8.5–9.5之间。
   3. 涡旋 30 分钟。
   4. 用 50 μL 溶于 20 mM Tris（pH 8.0）中的 100 mM 甘氨酸终止反应。
   5. 以最大速度离心10分钟，将上清液转移至新管中。
      ​注意： 生物素化聚赖氨酸（Bio-PLL）的质量通常通过将其连续两倍稀释后包被到96孔ELISA板上，再与碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素孵育，定量生物素含量，以此与先前制备的样品进行比较。
5. 移除封闭缓冲液，切勿让孔干燥。加入链霉亲和素（100 µg/mL，溶于封闭缓冲液中），4 °C孵育1小时。
6. 用 HBS 洗涤。将腔室载玻片的孔进行填充并倒置 4–5 次，彻底去除孔中的 HBS。切勿让孔干燥。
7. 将生物素化的pMHC配体和黏附分子添加至表面。
   注意： MCC 和 OVA 可通过添加基于邻硝基苄基的保护基团进行光笼修饰（例如， 硝基苯乙基（NPE）或硝基愈创木氧羰基（NVOC）对关键赖氨酸残基（MCC中的K12，OVA中的K7）的ε-氨基进行光笼修饰。光笼化MCC和OVA可从商业供应商处获得。在水相缓冲液中重悬后，将其与细菌表达的I-E分子重新折叠结合^k 和 H2-K^b 采用既定方法。
8. 光可激活MCC或OVA肽的验证
   1. 使用手持式紫外灯照射以脱保护十肽NVOC，见 材料表室温下孵育 20 分钟。
   2. 脉冲 1.0 x 10⁵ APCs 加入 1 µM 非刺激性肽段（阴性对照， 例如 血红蛋白（Hb）、未照射的光活化肽、照射后的光活化肽以及激动剂肽（阳性对照， 例如，MCC）在37 °C下孵育1小时至过夜。
   3. 刺激表达5C.C7/2B4/AND TCR的T细胞时，使用CH12或CH27 B细胞；刺激OT1 T细胞时，使用RMA-s或EL4胸腺瘤细胞。
   4. 将脉冲处理的APC与等数量的T细胞在96孔圆底培养板中混合，终体积为200 µL。在37 °C孵育12–24小时。
   5. 从每个孔中回收上清液，并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶比色法检测通过ELISA分析IL-2。
      注意强烈建议在将所有肽段折叠成MHC复合物之前，通过电喷雾质谱法确认其笼状状态。
9. 进行MHC的折叠和纯化时，应尽量减少光照暴露。例如，用铝箔包裹折叠反应管，并在关闭紫外灯的条件下进行凝胶过滤层析。
   注意： 已发现光可激活的MCC-I-E^k 和 OVA-H2-K^b 在高密度下可能由于功能封闭不完全，导致不依赖紫外线的T细胞激活。因此，将光激活型pMHC稀释至过量10–30倍的非刺激性pMHC中，例如 I-E^k 在固定步骤中包含血红蛋白肽（Hb）。这可提高后续成像实验的信噪比。
10. 光激活CD4⁺ T细胞共同使用生物素标记的Hb-I-Ek（3 µg/mL）和生物素标记的光活化MCC-I-Ek的混合物^k (0.1 µg/mL) 及针对 MHC I 类分子 H2-K 的生物素化抗体^k (0.5 µg/mL)。抗H2-K^k 抗体促进表达H2-K的5C.C7/2B4/AND T细胞^k，使其在未活化的情况下即可在玻璃表面铺展。
11. 对于CD8⁺ T细胞使用含有肽段KAVYDFATL的生物素化H2-Db（1 µg/mL）、光活化生物素化OVA-H2-Kb（0.1 µg/mL）以及黏附分子ICAM-1的胞外结构域（2 µg/mL，由昆虫细胞培养产生）的混合物。ICAM-1通过与T细胞表面的整合素LFA1结合，促进紧密接触的形成。
12. 将所有蛋白混合物加入封闭缓冲液中，随后在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育至少2小时。
    注意： 此类表面的分子密度先前已确定为约每平方微米8000个分子。鉴于光激活型pMHC约占表面生物素化蛋白的1/30，其在解笼前的密度约为每平方微米267个分子。
13. 按照步骤1.6进行洗涤，然后置于HBS中直至使用。
14. 加入200,000个CD4⁺ 或 CD8⁺ 将表达适当TCR的T细胞加入各孔中，于37 °C孵育15分钟使其贴壁。待细胞完全贴附并铺展后，即可进行光激活和成像。
    注意： 效应T细胞经逆转录病毒转导荧光成像探针的方法已在其他文献中详细描述。钙信号也可通过加载钙敏感性染料Fluo-46的未转导T细胞进行研究。不推荐使用比率型染料Fura-2，因其需要紫外光范围内的激发光，而该激发光会同时诱导光激活型pMHC的解笼反应。

2. 图像采集

1. 使用配备紫外兼容的150倍物镜的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜进行图像采集。利用连接至100 W汞灯（HBO）的数字光阑系统，对用户自定义区域进行紫外照射。通过400 nm长通二向色镜将该汞灯发出的紫外光直接引导至样品。
2. 使用图像分析软件进行局部光激活及延时成像采集。在大多数实验中，分别使用488 nm和561 nm激发激光监测绿色和红色通道中的探针。激光通过一个双通带二向色镜引导至样品，该二向色镜同时透射紫外光（以实现“解笼”）。有关显微镜配置的更多信息，请参见材料表和图1。
3. 安装含有T细胞的腔室载玻片后，根据需要调整设置以获得TIRF或落射荧光照明。在实时模式下，选择表达目标荧光探针的细胞视野。通过软件控制，在单个细胞下方设定微米尺度的光激活区域。
4. 开始延时成像采集。通常采集80个时间点，每两个时间点之间间隔5 s。对于双色实验，该间隔足以完成488 nm和563 nm的依次曝光。
5. 在采集至第10个时间点时，通过打开数字光阑快门1–1.5 s，对选定区域进行光激活。
6. 延时成像完成后，选择新的细胞视野并重复上述过程。

结果

图1：用于光激活与全内反射荧光成像的显微镜配置。

488 nm 和 561 nm 激光分别用于绿色和红色探针的全内反射荧光（TIRF）和落射荧光成像。光激活所需的紫外光来自一个连接了数字光圈系统的汞（Hg）灯，该系统能够照射用户自定义的小区域。来自汞灯/光圈的光线由位于二向色镜下方的长通反射镜反射至样品上，该二向色镜用于反射成像激光。该二向色镜必须设计为可透过紫外光。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc Lab-Tek 带孔盖玻片	Thermofischer Scientific	155361
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P2636	需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
EZ-Link NHS-生物素	Thermofischer Scientific	20217	需要制备生物素化聚-L-赖氨酸
链霉亲和素	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500：BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒	Avidity	BirA500	用于蛋白质的生物素标记
生物素化 Hb I-EK			关于蛋白质折叠，请参见参考文献6；关于生物素化，请使用 BirA 试剂盒
生物素化 NPE-MCC I-EK	Anaspec		可从 Anaspec 定制购买 NPE-MCC（HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH）
生物素化 αH2-Kk 抗体	BD Biosciences	553591
生物素化 NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		可从 Anaspec 定制购买 NPE-OVA（H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH）
生物素化 KAVY H2-Db	Anaspec		可从 Anaspec 定制合成蛋白质（KAVYDFATL）
生物素化 ICAM1			关于蛋白质折叠，请参见实验方案中的参考文献；关于生物素化，请使用 BirA 试剂盒
手持式紫外灯	UVP	UVGL-25	灯距离样品 < 1 cm。365 nm 光照 30 秒足以实现可检测的脱笼，20 分钟可实现定量脱笼。
Olympus IX-81 OMAC TIRF 系统	Olympus		有关成像系统的更多信息，请参见图6
Mosaic 数字光阑	Andor
Slidebook 软件	Intelligent Imaging Innovations