通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

摘要

来源：Martinelli, R. 等，用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。

方案

1. 准备人CD4⁺ Th1效应/记忆T细胞

1. 在供体手臂上绑上止血带，用酒精擦拭静脉，插入针头。使用含EDTA抗凝剂的真空采血管缓慢抽取15 ml血液。采血完成后，在拔出针头前先解开止血带。拔针后立即用无菌纱布对穿刺部位施加压力。
2. 将血液转移至50 ml离心管中。在室温下以1:1比例加入RPMI-1640培养基（终体积为30 ml）。小心地将稀释后的血液叠加到两个已装有15 ml预过滤淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）的50 ml离心管中，分离液温度为室温。
3. 在室温下使用水平转子离心机以1,200 × g离心30分钟。离心期间，配制T细胞培养基（500 ml RPMI-1640、50 ml胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素）。
4. 从离心机取出50 ml离心管后，可见四层：底部为红细胞沉淀，其上为Ficoll层，再上为含有白细胞（包括淋巴细胞）的细胞层，最上层为血浆。用巴氏吸管小心吸取白细胞层，并转移至一个50 ml Falcon管中。
5. 通过加入室温RPMI-1460培养基（最多至20 ml）洗涤白细胞层，并在室温下以1,200 × g离心5分钟。将白细胞重悬于1 ml T细胞培养基中。取5 µl上述1 ml细胞悬液加入含250 µl T细胞培养基的1.5 ml离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
6. 取25 µl稀释后的细胞悬液与25 µl 0.4%台盼蓝溶液混合。将10 µl混合液分别加入标准血细胞计数板两侧的计数区域。
7. 将血细胞计数板置于低倍光学显微镜下，使用10倍物镜计数两侧计数板中央大方格内未被台盼蓝染色的活细胞数量。
8. 计算细胞浓度时，取两个大方格计数结果的平均值，乘以100（稀释倍数），再乘以10⁴ ，即得每毫升细胞数。
9. 用T细胞培养基将细胞终浓度调整为0.5 × 10⁶ 个细胞/ml。向细胞悬液中加入终浓度均为1 µg/ml的细菌超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和中毒性休克综合征毒素1（TSST-1）。在37 °C、5% CO₂条件下培养72小时，以扩增CD4⁺ T细胞群体。
10. 将T细胞以1,200 × g离心5分钟，沉淀后重悬于含人IL-15（20 ng/ml）的T细胞培养基中，调整细胞浓度为0.5 × 10⁶ 个细胞/ml。将淋巴细胞转移至T150培养瓶中。根据培养基颜色变化（ i.e.，当培养基由粉红色变为微黄色时），每24–48小时在完全培养基中补充IL-15并传代扩增细胞。所得淋巴细胞群体可维持培养长达15天。
    注意：本方案旨在特异性激活并扩增对SEB和TSST-1有反应的CD4⁺ T细胞亚群，并诱导其向Th1样效应/记忆表型分化。其他白细胞在此培养条件下无法存活和增殖，因此在步骤1.10时，细胞中CD4⁺、CD45RO⁺ T细胞比例可达95%以上，可通过流式细胞术轻松验证。如需更高纯度，可使用市售的抗体/磁珠介导的阳性或阴性分选试剂盒进一步纯化。

2. 建立原代人内皮细胞培养

1. 在无菌条件下，用含20 µg/ml纤连蛋白（FN）的PBS包被T25培养瓶，在室温下孵育30–60分钟。去除FN溶液，加入5 ml完全培养基（内皮基础培养基（EBM-2）添加内皮生长培养基（EGM-2）单份添加剂）。在37 °C细胞培养箱中预孵育至少30分钟。
2. 将一管冻存的人肺或皮肤微血管内皮细胞（HLMVECs或HDMVECs）在37 °C水浴中解冻，期间轻轻振荡约2–3分钟。立即转移细胞至含有预热培养基的T25培养瓶中，轻轻摇匀后放入37 °C培养箱中。
3. 约4–6小时后更换培养基。此后每约48小时（或当培养基略变黄时）更换一次培养基，直至培养瓶中细胞融合度达到约90–95%。

3. 内皮细胞的一般分裂与扩增

1. 将细胞培养至约90-95%融合度，此过程可能需要2-5天。传代时，吸除培养基，并用PBS洗涤。吸除PBS后，加入最小体积的新鲜1×胰蛋白酶溶液（T25培养瓶加0.5 ml，T75培养瓶加1.5 ml），轻轻晃动使胰蛋白酶覆盖所有表面。在37 °C孵育约5分钟，使用低倍光学显微镜观察细胞从培养皿表面脱落的情况。
2. 当大部分细胞呈现圆形或已脱落时，加入胰蛋白酶体积5倍量的预温全EGM-2培养基（i.e. ），并用移液器轻柔吹打培养瓶表面，使所有细胞完全脱落。
3. 按1.6–1.7节所述方法，使用血细胞计数板对内皮细胞进行计数。通过离心（5分钟，1,200 × g）收集细胞，弃去上清液。加入预温的完全EGM-2 MV培养基，调整细胞浓度至每毫升含50万个细胞。
4. 将细胞分装至适当的纤连蛋白（FN）包被培养皿或培养瓶中进行常规培养。轻轻晃匀后放入培养箱。接种后6–12小时内更换培养基，之后大约每48小时更换一次培养基。

4. 内皮细胞转染

注意：原代内皮细胞对最常见的化学转染和电穿孔方法具有抗性。下文所述基于核转染的方法可实现相对较高的转染效率（约50–70%）。一种有效的替代方法是使用适当的病毒载体进行感染（参见 材料 表中的注释）。

1. 将 HLMVECs 或 HDMVECs 接种于所需数量的 T25 或 T75 培养瓶中，培养至最终密度为 90–95% 汇合度。在无菌条件下，用含 20 µg/mL 纤连蛋白（FN）的 PBS 溶液对用于显微镜观察的培养板（如 Delta-T 板，适用于步骤 5）或置于 24 孔细胞培养板孔内的 12 mm 圆形玻璃盖玻片（适用于步骤 6）进行包被，操作方法同上文（2.1）所述。
2. 向显微镜培养板中加入 1 mL 完全 EGM-2 培养基，或向每个 24 孔加入 0.5 mL，随后将培养板置于湿润的 37 °C / 5% CO₂ 培养箱中平衡。
3. 按照步骤 3.1–3.3 所述方法收获并计数内皮细胞。将所需体积的细胞（每样本 50 万个细胞）在室温下以 1,200 × g 离心 5 分钟。每样本用 100 µL 室温核转染溶液小心重悬细胞沉淀。
4. 将 100 µL 细胞悬液与 1–5 µg DNA 混合。将细胞/DNA 混悬液转移至认证的电穿孔杯中；样本必须覆盖电穿孔杯底部且无气泡。
   注意： 使用靶向定位至细胞膜的 YFP 或 DsRed 构建体（通过神经调节蛋白 N 端 20 个氨基酸序列实现翻译后棕榈酰化修饰信号引导），可单独转染（仅表达膜定位 YFP 或膜定位 DsRed），也可与细胞质体积标记物共转染（例如 膜定位 YFP 与可溶性 DsRed）。多种荧光蛋白标记组合均可使用。
5. 盖上电穿孔杯盖。将含细胞/DNA 混悬液的电穿孔杯插入电穿孔仪的电穿孔杯架中，运行程序 S-005。程序完成后取出电穿孔杯。
6. 向电穿孔杯中加入约 500 µL 预先平衡的培养基，使用核转染试剂盒提供的塑料移液管轻轻将细胞悬液从电穿孔杯中转移出来。
7. 对于使用显微镜培养板的实验，将一次反应的细胞悬液等分为两份，分别加入含有预温培养基的两个培养皿中（见步骤 4.2–4.3）。对于使用 24 孔板的实验，将一次反应的细胞悬液等分为三份，分别加入三个孔中。
8. 将细胞置于湿润的 37 °C / 5% CO₂ 培养箱中孵育，并在转染后 4–6 小时及 12–16 小时更换培养基。

5. 活细胞成像与分析

1. 准备内皮细胞
   1. 第0天：通过核转染技术（如步骤4所述）将膜定位YFP和可溶性DsRed共转染至原代人肺微血管内皮细胞（HLMVECs），并接种于活细胞成像培养板中。
   2. 第1天：更换为含干扰素-γ（IFN-γ，100 ng/ml）的新鲜培养基，以诱导MHC-II表达。第2天，在现有培养基中加入20 ng/ml肿瘤坏死因子-α（TNF-α），刺激转染细胞。
   3. 第3天，在实验开始前，将内皮细胞与各1 µg/ml的细菌超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和中毒性休克综合征毒素1（TSST）在37 °C共孵育30–60分钟。对于无抗原（“-Ag”）对照条件，省略此步骤。
2. 准备淋巴细胞
   1. 与步骤5.1.3同时进行，配制缓冲液A（不含酚红的HBSS），添加20 mM HEPES（pH 7.4）和0.5% v/v人血清白蛋白，并预热至37 °C。取培养的淋巴细胞样品，用血细胞计数板计数以确定细胞密度（步骤1.12–1.17）。
   2. 每份样品取200万个细胞，在15 ml锥形管中于室温下以1,200 × g离心5分钟。吸除上清液，并用2 ml缓冲液A轻柔重悬细胞沉淀，确保无细胞团块残留。
   3. 取一份新鲜的Fura-2钙荧光染料，用DMSO重悬，配制成1 mM的储存液。
   4. 向T细胞悬液中加入2 μl Fura-2储存液（终浓度为2 μM），盖紧管盖，立即通过反复倒置混匀，确保染料均匀分散。于37 °C孵育30分钟。
   5. 按步骤5.2.2条件离心。吸除缓冲液A，并用20–40 μl新鲜缓冲液A轻柔但彻底地重悬淋巴细胞。
3. 活细胞成像设置与图像采集 
   ​注意：可使用多种系统在直立或倒置光学显微镜上进行活细胞荧光成像。基本要求包括荧光光源与滤光片、CCD相机、电动滤光轮与快门、加热载物台（或可安装于显微镜的加热腔室），以及用于自动图像采集的软件。本方案需使用高数值孔径、高倍率（即，40X、63X）的油浸物镜，以获得必要的空间分辨率。在选择适用于Fura-2钙成像的荧光光源和物镜时需特别注意，并非所有设备均兼容所需的340/380 nm激发波长。也可采用替代方法（兼容标准绿色和红色荧光滤光片组），使用非比率型钙敏感染料（例如，Fluo-4、Rhod-3），但此类染料无法准确量化钙离子流，仅能提供相对或半定量读数。
   1. 开启显微镜系统（操作用电脑、显微镜、CCD相机、滤光轮和氙灯）。
   2. 打开指定软件。
   3. 设置显微镜/软件以进行多通道自动延时成像。包括差分干涉对比（DIC）、标准绿色荧光、标准红色荧光，以及标准340 nm和380 nm激发的Fura-2图像的顺序采集。设定图像采集间隔为10–30秒，总持续时间约为20–60分钟。
      1. 设置Fura-2成像的曝光时间。
         1. 添加新鲜的物镜油，并将仅含0.5 ml缓冲液A的显微镜培养皿安装至加热载物台适配器上，立即开启加热，使其平衡至37 °C（约需2–3分钟）。
         2. 使用20 μl移液器将静息状态的Fura-2负载淋巴细胞加入已安装的显微镜培养皿腔室中。
         3. 开启明场成像。选择光路至目镜。使用粗调焦旋钮使物镜接触培养皿底部，再通过目镜和细调焦旋钮对准沉降在皿底的T细胞进行聚焦。
         4. 使用x-y载物台控制选择至少包含10个细胞的视野。避免过于密集的区域和细胞团块，以免产生成像伪影。
         5. 从明场切换至荧光光源，从目镜成像切换至CCD相机。设置采集参数（例如，曝光时间、探测器增益和像素合并）。使用软件采集静息状态下的Fura-2-340和Fura-2-380图像（初始曝光时间相同，通常在~200–1,000毫秒范围内）。
         6. 采用步骤5.4.1所述方法计算每个淋巴细胞的Fura-2-340/Fura-2-380比值。反复调整Fura-2-340和Fura-2-380的曝光时间、采集图像并计算比值，直至平均值接近1。
      2. 设置mem-YFP和DsRed的曝光时间。
         1. 将步骤5.3.3.1中使用的显微镜培养皿替换为来自细胞培养孵箱的转染、激活并经SAg处理（或未处理；对照）的HLMVECs或HDMVECs培养皿（步骤4.5.1）。使用一次性转移移液器快速移除培养基，加入约1 ml预热的缓冲液A进行一次冲洗，吸除后加入0.5 ml缓冲液A。
         2. 选择荧光强烈、转染阳性且细胞状态良好、细胞间连接清晰的内皮细胞视野。
         3. 调整mem-YFP和DsRed的采集参数（例如，曝光时间、探测器增益和像素合并），确保各通道的平均荧光信号强度处于探测器动态范围的25%至75%之间。
4. 进行活细胞成像实验。
   1. 使用自动化软件开始图像采集，连续捕获多个时间点的图像以建立基线。
   2. 在采集过程中，通过将小体积（P-5或P-20）移液器的吸头插入物镜中心附近的培养基中，缓慢推出约5 μl浓缩的Fura-2负载淋巴细胞（来自步骤5.2），将其加入显微镜培养皿的成像区域中心。
   3. 当淋巴细胞沉降至成像视野后，微调焦距，确保T细胞与内皮细胞界面（免疫突触）保持在焦平面内。使用40倍和63倍物镜时，每视野约10–20个细胞为最佳。若视野中细胞数量过少，重复步骤5.3.4.2。
   4. 当实验所需的观察时段结束后，继续成像，并立即使用与步骤5.3.4.2相同的技术，将离子霉素直接加入显微镜培养皿中，终浓度为2 μM，以诱导最大钙离子流/Fura-2信号（即，作为校准手段，参见分析部分5.4）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 无乳胶弹力止血带	BD Biosciences	367203
BD 酒精棉片	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer 按压式采血套装	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	使用前恢复至室温
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	热灭活
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
金黄色葡萄球菌肠毒素 B	Toxin Technology	BT202RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
中毒性休克综合征毒素 1	Toxin Technology	TT606RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
人 IL-15	R&D Systems	247-IL-025	储存液：50 μg/ml PBS 溶液
PBS	Life Technologies	10010-049
纤维连接蛋白	Life Technologies	33016-015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
HMVEC-d Ad-真皮微血管内皮细胞	Lonza	CC-2543	可使用其他人微血管内皮细胞，例如 HLMVECs
EGM-2 MV 子弹式培养基试剂盒	Lonza	CC-3202
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	储存液：10×，用 PBS 稀释
Amaxa-HMVEC-L 核转染试剂盒	Lonza	vpb1003	步骤 4 所需试剂盒
IFN-γ	Sigma-Aldrich	I3265	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
人 TNF-α 10 μg	Life Technologies	PHC3015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
无酚红 HBSS	Life Technologies	14175-103
HEPES	Fisher Scientific	BP299-100
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016-100G	储存液：1 M H₂O 溶液
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337	储存液：1 M H₂O 溶液
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F 无荧光浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20×50 μg	Life Technologies	F1221	储存液：1 mM DMSO 溶液
pEYFP-Mem（膜定位 YFP）	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer（可溶性细胞质 DsRed）	Clontech	632466
pDsRed-Monomer 膜定位（Mem-DsRed）	Clontech	632512
pEGFP-肌动蛋白	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
Falcon 组织培养处理 T25 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-9
Falcon 组织培养处理 T75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
Corning 组织培养处理 T175 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-61
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-85	直径 12 mm
Falcon 24 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T 培养板	Bioptechs	04200415B
Wheaton 一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 小鼠抗人抗体	BD Biosciences	555509
HS1 小鼠抗人抗体	BD Biosciences	610541
抗人 CD11a（LFA-1α）纯化抗体	ebioscience	BMS102
抗人 CD3 Alexa Fluor® 488 标记抗体	ebioscience	53-0037-41
抗 MHC II 类抗体	Abcam	ab55152
抗 Talin 1 抗体	Abcam	ab71333
抗 PKC theta 抗体	Abcam	ab109481
磷酸化酪氨酸抗体（4G10 Platinum）	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		步骤 4 所需电穿孔仪
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison 软件	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425（Series 60）生物安全柜	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱	Fisher Scientific	202370
Centrifuge 5810	Eppendorf	EW-02570-02
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血细胞计数板
Isotemp 水浴锅 202 型	Fisher Scientific	15-462-2