通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

摘要

来源：Martinelli, R. 等，用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。

方案

1. 准备人CD4⁺ Th1效应/记忆T细胞

1. 在供体手臂上绑上止血带，用酒精擦拭静脉，插入针头。使用含EDTA抗凝剂的真空采血管缓慢抽取15 ml血液。采血完成后，在拔出针头前先解开止血带。拔针后立即用无菌纱布对穿刺部位施加压力。
2. 将血液转移至50 ml离心管中。在室温下以1:1比例加入RPMI-1640培养基（终体积为30 ml）。小心地将稀释后的血液叠加到两个已装有15 ml预过滤淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）的50 ml离心管中，分离液温度为室温。
3. 在室温下使用水平转子离心机以1,200 × g离心30分钟。离心期间，配制T细胞培养基（500 ml RPMI-1640、50 ml胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素）。
4. 从离心机取出50 ml离心管后，可见四层：底部为红细胞沉淀，其上为Ficoll层，再上为含有白细胞（包括淋巴细胞）的细胞层，最上层为血浆。用巴氏吸管小心吸取白细胞层，并转移至一个50 ml Falcon管中。
5. 通过加入室温RPMI-1460培养基（最多至20 ml）洗涤白细胞层，并在室温下以1,200 × g离心5分钟。将白细胞重悬于1 ml T细胞培养基中。取5 µl上述1 ml细胞悬液加入含250 µl T细胞培养基的1.5 ml离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
6. 取25 µl稀释后的细胞悬液与25 µl 0.....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 无乳胶弹力止血带	BD Biosciences	367203
BD 酒精棉片	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer 按压式采血套装	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	使用前恢复至室温
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	热灭活
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
金黄色葡萄球菌肠毒素 B	Toxin Technology	BT202RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
中毒性休克综合征毒素 1	Toxin Technology	TT606RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
人 IL-15	R&D Systems	247-IL-025	储存液：50 μg/ml PBS 溶液
PBS	Life Technologies	10010-049
纤维连接蛋白	Life Technologies	33016-015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
HMVEC-d Ad-真皮微血管内皮细胞	Lonza	CC-2543	可使用其他人微血管内皮细胞，例如 HLMVECs
EGM-2 MV 子弹式培养基试剂盒	Lonza	CC-3202
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	储存液：10×，用 PBS 稀释
Amaxa-HMVEC-L 核转染试剂盒	Lonza	vpb1003	步骤 4 所需试剂盒
IFN-γ	Sigma-Aldrich	I3265	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
人 TNF-α 10 μg	Life Technologies	PHC3015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
无酚红 HBSS	Life Technologies	14175-103
HEPES	Fisher Scientific	BP299-100
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016-100G	储存液：1 M H₂O 溶液
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337	储存液：1 M H₂O 溶液
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F 无荧光浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20×50 μg	Life Technologies	F1221	储存液：1 mM DMSO 溶液
pEYFP-Mem（膜定位 YFP）	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer（可溶性细胞质 DsRed）	Clontech	632466
pDsRed-Monomer 膜定位（Mem-DsRed）	Clontech	632512
pEGFP-肌动蛋白	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
Falcon 组织培养处理 T25 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-9
Falcon 组织培养处理 T75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
Corning 组织培养处理 T175 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-61
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-85	直径 12 mm
Falcon 24 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T 培养板	Bioptechs	04200415B
Wheaton 一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 小鼠抗人抗体	BD Biosciences	555509
HS1 小鼠抗人抗体	BD Biosciences	610541
抗人 CD11a（LFA-1α）纯化抗体	ebioscience	BMS102
抗人 CD3 Alexa Fluor® 488 标记抗体	ebioscience	53-0037-41
抗 MHC II 类抗体	Abcam	ab55152
抗 Talin 1 抗体	Abcam	ab71333
抗 PKC theta 抗体	Abcam	ab109481
磷酸化酪氨酸抗体（4G10 Platinum）	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		步骤 4 所需电穿孔仪
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison 软件	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425（Series 60）生物安全柜	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱	Fisher Scientific	202370
Centrifuge 5810	Eppendorf	EW-02570-02
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血细胞计数板
Isotemp 水浴锅 202 型	Fisher Scientific	15-462-2