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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 乳腺癌发展的转基因小鼠模型
- 观察所选癌症模型小鼠的肿瘤生长情况 通过 在继续操作前进行触诊或卡尺测量。
注意： 在此研究中采用了乳腺癌发生的转基因小鼠模型（FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J）（MMTV-PyMT）。这些小鼠在6至12周龄期间会自发地在每侧乳腺中形成侵袭性乳腺癌。对照组使用了无转基因、同窝出生且年龄匹配的野生型小鼠的正常乳腺组织。
2. 特异性与非特异性抗体试剂的静脉注射
- 使用脱盐柱（例如 PD-10）纯化兔抗小鼠 B7-H3 抗体及兔免疫球蛋白 G（IgG）同型对照抗体，以去除防腐剂和储存缓冲液，操作遵循制造商说明书。
注意：某些抗体可能需要进一步采用基于蛋白 A 琼脂糖珠的方案进行纯化。
- 将每种抗体偶联物以 33 µg 剂量分装至独立的微量离心管中。
注意：给药剂量可能因应用而异，应与该抗体偶联物常规使用的剂量一致。若体积超过 100 µL，需调整抗体溶液浓度以确保动物安全。
- 在组织采集前的预定时间点（此处为 96 小时），以每分钟 2 升氧气流中含 2% 异氟烷的气体麻醉荷瘤动物，并将其置于 37 °C 加热台上。通过夹趾反应确认动物在操作前已达到适当的麻醉深度。
- 为准备抗体溶液的尾静脉接种，用酒精棉片擦拭动物尾部三次进行消毒。用加热垫加热约 30 秒以扩张尾静脉，注意避免加热整个动物。移除加热垫后，再次用酒精棉片擦拭尾部一次。
- 使用 27G 尾静脉套管针，将蝶形针插入两条侧尾静脉之一，并用外科胶带将带针的尾部小心固定于台上。
注意：套管内可见血液回流表明针头已正确置入尾静脉内。
- 用 25 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗套管，然后使用胰岛素注射器将抗体溶液注入套管。再次用 25 µL 无菌 PBS 冲洗套管。
- 从尾部拔出针头，并施加压力以止住任何出血。
- 关闭麻醉气体，观察动物直至其完全清醒，并检查是否有任何痛苦迹象。
3. 目标肿瘤组织的采集与制备
- 在预定时间点，按照机构认可的安乐死程序人道处死动物，此处采用逐渐吸入100% CO的方法2 来自压缩气罐，腔室置换流速为10-30%体积/分钟。
注意： IVIL 技术的某些应用需要通过 PBS 心脏灌注以清除循环抗体，从而实施安乐死。
- 在确认动物经人道安乐死后出现呼吸和心跳停止、脚趾夹捏无反应以及黏膜发灰等现象后，使用手术剪和镊子按如下步骤切除肿瘤组织：
- 将小鼠仰卧放置，用镊子夹住靠近尾部最后一对（第5对）乳腺外层皮肤，用手术剪做一个小切口。
- 将闭合的剪刀插入切口，缓慢张开剪刀尖端，小心分离皮肤与下方腹壁膜，保持腹壁膜完整。
- 沿腹部做一纵向切口，继续将皮肤与内层膜分离。在第3和第4对乳腺之间，横向切开腹部，以便牵拉皮肤并暴露乳腺组织。
注意： 乳腺肿瘤和腺体位于皮肤下方的浅层。
- 用镊子夹住每个肿瘤或正常腺体，用手术剪小心剪除附着的皮肤。
- 将切除的组织置于预先标记并填充了最佳切割温度（OCT）包埋介质的一次性组织底模中，并通过放置于干冰上快速冷冻模具。为研究脱靶递送情况，可切除其他感兴趣的组织或器官（例如.肝脏或肺部）
注意： 如需在此处暂停实验流程，可将冷冻组织块保存于 -80 °C，待需要时再继续后续操作。
- 使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚度的切片，并将相邻切片置于预先标记的黏附载玻片上。
注意： 如需在此处暂停实验流程，可将载玻片保存于 -80 °C，待需要时再继续后续操作。
4. 离体染色方案
注意：为了对荧光显微镜图像进行定量比较，所有载玻片均需使用同时配制的相同溶液进行染色。
- 用室温 PBS 冲洗冷冻组织切片 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂。
- 使用疏水屏障笔标记组织切片区域，以减少染色过程中所需溶液的用量。
注意： 注意避免笔尖划过组织样本，以免导致组织从载玻片上脱落或影响受累区域的正常染色。在任何步骤中均应防止组织切片脱水。
- 用4%多聚甲醛溶液固定组织切片5分钟。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含 0.5% Triton-X 100 的 PBS 溶液孵育组织切片 15 分钟以进行透化处理。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含3% w/v牛血清白蛋白（BSA）和5% v/v山羊血清的PBS溶液（封闭液）在室温下封闭组织1小时。
注意： 使用与二抗宿主动物相匹配的封闭液血清。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 根据需要，将切片与用于记录保存的初级抗体共同孵育，可能包括常见的核标记物（如 DAPI）、血管标记物（如 CD31）或胞质标记物（如 actin）。此处按照制造商说明书，将大鼠抗小鼠 CD31 抗体（血管标记物）以 1:100 稀释度溶于封闭液中，于 4 °C 在载玻片架上避光避脱水孵育过夜。
注意： 不要添加额外的一抗或抗体偶联物。已注射并允许在组织中积累的偶联物 体内 作为一抗。
- 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 使用二抗孵育切片以标记一抗。本实验中，在阻断液中，用AlexaFluor-546标记的山羊抗兔抗体（1:200稀释，根据制造商说明书优化）标记抗B7-H3抗体，同时用AlexaFluor-488标记的山羊抗大鼠抗体（1:200稀释，根据制造商说明书优化）标记CD31，置于切片架上避光并防止干燥，室温孵育1小时。
注意： 二抗来自同一宿主动物，但其亲和力需与相应一抗的宿主物种相匹配。从此步骤开始，需将载玻片避光保存。
- 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 在组织切片中央滴加一滴封片剂，小心地加盖盖玻片，避免产生气泡。
- 用透明指甲油密封盖玻片边缘，并静置干燥。
注意： 如需在此步骤暂停实验方案长达一周，可将载玻片置于 -20 °C 保存，待准备继续时再进行后续操作。
5. 共聚焦显微镜成像与定量图像分析
注意：共聚焦显微镜的准备及成像参数设置将取决于所使用的共聚焦系统。此处使用的显微镜为商业购置（例如，Zeiss LSM 510 Meta 系统），并使用相应的采集软件（例如，Zen 2009）。然而，这些步骤中的大多数适用于任何共聚焦显微镜，并假设使用者具备共聚焦显微镜的基本知识。
- 系统开启并预热后，选择所需物镜；此处使用了 20 倍（数值孔径 = 0.8）物镜。
- 将阳性对照玻片盖玻片朝下放入载物台，以便针对最强信号进行优化设置。在红色通道成像时，于实时成像模式下对样本进行聚焦。
- 对所使用的每个激光通道，按以下步骤优化激光强度、主增益和针孔大小：
- 切换至连续成像模式。
- 在监控查找表（LUT）直方图的同时，调节激光强度（控制激光功率）和增益（主）（控制光电倍增管电压）滑块。调整这两个参数，使直方图的动态范围被充分填充，同时避免像素饱和。
注意：若激光强度过高，将导致光漂白；若增益（主）过高，图像将出现噪声。理想情况下，增益（主）应处于其范围的中间值。
- 将针孔设置为 1 阿贝单位（AU），以获得最高分辨率和最薄的 z 轴切片。
- 滑动数字偏移条，使 LUT 直方图的噪声基底最小化，从而实现真正的黑色背景。
注意：一旦为每个激光通道和物镜优化了显微镜设置，在整个成像过程以及所有玻片的成像中应保持这些参数恒定，以便在不同玻片间进行定量比较。
- 在采集模式选项卡下的平均设置中，选择所需的数量和位深度。点击“最优”按钮以设定最佳像素尺寸。
- 使用快照采集按钮获取高质量图像。此处从肿瘤内部随机选择视野，但其他应用可能关注不同区域（如血管、肿瘤边缘、穿透深度等）。
- 将图像文件保存为共聚焦软件所用格式（此处为“.lsm”），用于离线处理和定量分析。
注意：若未在同一次会话中完成所有玻片的成像，应保存设置并在后续使用时重新加载；但由于光漂白的影响，不建议重新对同一玻片进行成像。
- 进行定量荧光强度测量。打开 Fiji（Fiji Is Just ImageJ 软件），通过将 .lsm 图像文件拖拽至状态栏来加载图像。
- 拆分颜色通道数据。进入图像 > 图像栈 > 拆分通道。
- 根据需要对荧光图像进行预处理，例如减去背景信号（处理 > 减去背景），或通过滤波方法降低噪声。
- 通过设定信号强度阈值，对参考蛋白（血管、核、细胞染色）对应的颜色通道进行分割（图像 > 调整 > 阈值）。
注意：手动设定阈值会引入图像分析的主观性，因此建议使用自动阈值算法或参考图像直方图，以减少分析结果的偏差。
- 使用该阈值生成二值化掩膜（处理 > 二值化 > 转换为掩膜）。
- 在掩膜内测量并标记感兴趣区域（ROI）（分析 > 分析颗粒 > 勾选“添加至管理器” > 确定）。
- 将 ROI 应用于目标抗体对应的颜色通道（点击通道图像，分析 > 工具 > ROI 管理器 > 测量）。此操作会将掩膜 ROI 应用于抗体图像，并在结果窗口中提供标签区域的测量数据。保存结果窗口（文件 > 保存）。
- 计算所需的统计量，例如此处所述的平均荧光强度。
- 对一组玻片中的每幅图像均执行完全相同的处理步骤。可创建宏程序，以自动处理大批量图像。
- 仅在完成定量测量后用于图像展示时，可进行定性图像调整，通过将所有玻片的最小值、最大值、亮度和对比度调节至相同水平，以优化生物分布模式的可视化效果（图像 > 调整 > 亮度/对比度）。
- 转换图像类型（图像 > 类型 > RGB 颜色），并将文件保存为无损格式（如 .tiff）（文件 > 另存为 > Tiff…），用于展示和发表。