来源：Wischhusen, J. C.，等。体内免疫荧光定位法用于评估治疗性和诊断性抗体在癌症研究中的生物分布。J. Vis. Exp. (2019)。
本视频演示了一种 体内 采用免疫荧光定位（IVIL）技术研究肿瘤靶向抗体在乳腺癌小鼠模型中的生物分布。将肿瘤特异性抗体经静脉注射至小鼠体内后，手术分离肿瘤组织，确认抗体在肿瘤组织内的定位情况 通过离体 免疫染色
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方法文章
一种用于研究抗体体内分布的活体免疫荧光定位方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 乳腺癌发展的转基因小鼠模型
- 观察所选癌症模型小鼠的肿瘤生长情况 通过 在继续操作前进行触诊或卡尺测量。
注意： 在此研究中采用了乳腺癌发生的转基因小鼠模型（FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J）（MMTV-PyMT）。这些小鼠在6至12周龄期间会自发地在每侧乳腺中形成侵袭性乳腺癌。对照组使用了无转基因、同窝出生且年龄匹配的野生型小鼠的正常乳腺组织。
2. 特异性与非特异性抗体试剂的静脉注射
- 使用脱盐柱（例如 PD-10）纯化兔抗小鼠 B7-H3 抗体及兔免疫球蛋白 G（IgG）同型对照抗体，以去除防腐剂和储存缓冲液，操作遵循制造商说明书。
注意：某些抗体可能需要进一步采用基于蛋白 A 琼脂糖珠的方案进行纯化。 - 将每种抗体偶联物以 33 µg 剂量分装至独立的微量离心管中。
注意：给药剂量可能因应用而异，应与该抗体偶联物常规使用的剂量一致。若体积超过 100 µL，需调整抗体溶液浓度以确保动物安全。 - 在组织采集前的预定时间点（此处为 96 小时），以每分钟 2 升氧气流中含 2% 异氟烷的气体麻醉荷瘤动物，并将其置于 37 °C 加热台上。通过夹趾反应确认动物在操作前已达到适当的麻醉深度。
- 为准备抗体溶液的尾静脉接种，用酒精棉片擦拭动物尾部三次进行消毒。用加热垫加热约 30 秒以扩张尾静脉，注意避免加热整个动物。移除加热垫后，再次用酒精棉片擦拭尾部一次。
- 使用 27G 尾静脉套管针，将蝶形针插入两条侧尾静脉之一，并用外科胶带将带针的尾部小心固定于台上。
注意：套管内可见血液回流表明针头已正确置入尾静脉内。 - 用 25 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗套管，然后使用胰岛素注射器将抗体溶液注入套管。再次用 25 µL 无菌 PBS 冲洗套管。
- 从尾部拔出针头，并施加压力以止住任何出血。
- 关闭麻醉气体，观察动物直至其完全清醒，并检查是否有任何痛苦迹象。
3. 目标肿瘤组织的采集与制备
- 在预定时间点，按照机构认可的安乐死程序人道处死动物，此处采用逐渐吸入100% CO的方法2 来自压缩气罐，腔室置换流速为10-30%体积/分钟。
注意： IVIL 技术的某些应用需要通过 PBS 心脏灌注以清除循环抗体，从而实施安乐死。 - 在确认动物经人道安乐死后出现呼吸和心跳停止、脚趾夹捏无反应以及黏膜发灰等现象后，使用手术剪和镊子按如下步骤切除肿瘤组织：
- 将小鼠仰卧放置，用镊子夹住靠近尾部最后一对（第5对）乳腺外层皮肤，用手术剪做一个小切口。
- 将闭合的剪刀插入切口，缓慢张开剪刀尖端，小心分离皮肤与下方腹壁膜，保持腹壁膜完整。
- 沿腹部做一纵向切口，继续将皮肤与内层膜分离。在第3和第4对乳腺之间，横向切开腹部，以便牵拉皮肤并暴露乳腺组织。
注意： 乳腺肿瘤和腺体位于皮肤下方的浅层。 - 用镊子夹住每个肿瘤或正常腺体，用手术剪小心剪除附着的皮肤。
- 将切除的组织置于预先标记并填充了最佳切割温度（OCT）包埋介质的一次性组织底模中，并通过放置于干冰上快速冷冻模具。为研究脱靶递送情况，可切除其他感兴趣的组织或器官（例如.肝脏或肺部）
注意： 如需在此处暂停实验流程，可将冷冻组织块保存于 -80 °C，待需要时再继续后续操作。 - 使用冷冻切片机将冷冻组织块切成10 µm厚度的切片，并将相邻切片置于预先标记的黏附载玻片上。
注意： 如需在此处暂停实验流程，可将载玻片保存于 -80 °C，待需要时再继续后续操作。
4. 离体染色方案
注意：为了对荧光显微镜图像进行定量比较，所有载玻片均需使用同时配制的相同溶液进行染色。
- 用室温 PBS 冲洗冷冻组织切片 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂。
- 使用疏水屏障笔标记组织切片区域，以减少染色过程中所需溶液的用量。
注意： 注意避免笔尖划过组织样本，以免导致组织从载玻片上脱落或影响受累区域的正常染色。在任何步骤中均应防止组织切片脱水。 - 用4%多聚甲醛溶液固定组织切片5分钟。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含 0.5% Triton-X 100 的 PBS 溶液孵育组织切片 15 分钟以进行透化处理。
- 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 用含3% w/v牛血清白蛋白（BSA）和5% v/v山羊血清的PBS溶液（封闭液）在室温下封闭组织1小时。
注意： 使用与二抗宿主动物相匹配的封闭液血清。 - 用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。
- 根据需要，将切片与用于记录保存的初级抗体共同孵育，可能包括常见的核标记物（如 DAPI）、血管标记物（如 CD31）或胞质标记物（如 actin）。此处按照制造商说明书，将大鼠抗小鼠 CD31 抗体（血管标记物）以 1:100 稀释度溶于封闭液中，于 4 °C 在载玻片架上避光避脱水孵育过夜。
注意： 不要添加额外的一抗或抗体偶联物。已注射并允许在组织中积累的偶联物 体内 作为一抗。 - 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 使用二抗孵育切片以标记一抗。本实验中，在阻断液中，用AlexaFluor-546标记的山羊抗兔抗体（1:200稀释，根据制造商说明书优化）标记抗B7-H3抗体，同时用AlexaFluor-488标记的山羊抗大鼠抗体（1:200稀释，根据制造商说明书优化）标记CD31，置于切片架上避光并防止干燥，室温孵育1小时。
注意： 二抗来自同一宿主动物，但其亲和力需与相应一抗的宿主物种相匹配。从此步骤开始，需将载玻片避光保存。 - 用 PBS 冲洗载玻片，每次 5 分钟，共冲洗三次，每次更换 PBS。
- 在组织切片中央滴加一滴封片剂，小心地加盖盖玻片，避免产生气泡。
- 用透明指甲油密封盖玻片边缘，并静置干燥。
注意： 如需在此步骤暂停实验方案长达一周，可将载玻片置于 -20 °C 保存，待准备继续时再进行后续操作。
5. 共聚焦显微镜成像与定量图像分析
注意：共聚焦显微镜的准备及成像参数设置将取决于所使用的共聚焦系统。此处使用的显微镜为商业购置（例如，Zeiss LSM 510 Meta 系统），并使用相应的采集软件（例如，Zen 2009）。然而，这些步骤中的大多数适用于任何共聚焦显微镜，并假设使用者具备共聚焦显微镜的基本知识。
- 系统开启并预热后，选择所需物镜；此处使用了 20 倍（数值孔径 = 0.8）物镜。
- 将阳性对照玻片盖玻片朝下放入载物台，以便针对最强信号进行优化设置。在红色通道成像时，于实时成像模式下对样本进行聚焦。
- 对所使用的每个激光通道，按以下步骤优化激光强度、主增益和针孔大小：
- 切换至连续成像模式。
- 在监控查找表（LUT）直方图的同时，调节激光强度（控制激光功率）和增益（主）（控制光电倍增管电压）滑块。调整这两个参数，使直方图的动态范围被充分填充，同时避免像素饱和。
注意：若激光强度过高，将导致光漂白；若增益（主）过高，图像将出现噪声。理想情况下，增益（主）应处于其范围的中间值。 - 将针孔设置为 1 阿贝单位（AU），以获得最高分辨率和最薄的 z 轴切片。
- 滑动数字偏移条，使 LUT 直方图的噪声基底最小化，从而实现真正的黑色背景。
注意：一旦为每个激光通道和物镜优化了显微镜设置，在整个成像过程以及所有玻片的成像中应保持这些参数恒定，以便在不同玻片间进行定量比较。
- 在采集模式选项卡下的平均设置中，选择所需的数量和位深度。点击“最优”按钮以设定最佳像素尺寸。
- 使用快照采集按钮获取高质量图像。此处从肿瘤内部随机选择视野，但其他应用可能关注不同区域（如血管、肿瘤边缘、穿透深度等）。
- 将图像文件保存为共聚焦软件所用格式（此处为“.lsm”），用于离线处理和定量分析。
注意：若未在同一次会话中完成所有玻片的成像，应保存设置并在后续使用时重新加载；但由于光漂白的影响，不建议重新对同一玻片进行成像。 - 进行定量荧光强度测量。打开 Fiji（Fiji Is Just ImageJ 软件），通过将 .lsm 图像文件拖拽至状态栏来加载图像。
- 拆分颜色通道数据。进入图像 > 图像栈 > 拆分通道。
- 根据需要对荧光图像进行预处理，例如减去背景信号（处理 > 减去背景），或通过滤波方法降低噪声。
- 通过设定信号强度阈值，对参考蛋白（血管、核、细胞染色）对应的颜色通道进行分割（图像 > 调整 > 阈值）。
注意：手动设定阈值会引入图像分析的主观性，因此建议使用自动阈值算法或参考图像直方图，以减少分析结果的偏差。 - 使用该阈值生成二值化掩膜（处理 > 二值化 > 转换为掩膜）。
- 在掩膜内测量并标记感兴趣区域（ROI）（分析 > 分析颗粒 > 勾选“添加至管理器” > 确定）。
- 将 ROI 应用于目标抗体对应的颜色通道（点击通道图像，分析 > 工具 > ROI 管理器 > 测量）。此操作会将掩膜 ROI 应用于抗体图像，并在结果窗口中提供标签区域的测量数据。保存结果窗口（文件 > 保存）。
- 计算所需的统计量，例如此处所述的平均荧光强度。
- 对一组玻片中的每幅图像均执行完全相同的处理步骤。可创建宏程序，以自动处理大批量图像。
- 仅在完成定量测量后用于图像展示时，可进行定性图像调整，通过将所有玻片的最小值、最大值、亮度和对比度调节至相同水平，以优化生物分布模式的可视化效果（图像 > 调整 > 亮度/对比度）。
- 转换图像类型（图像 > 类型 > RGB 颜色），并将文件保存为无损格式（如 .tiff）（文件 > 另存为 > Tiff…），用于展示和发表。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | 杰克逊实验室 | 2374 | 雌性，4-6周龄 |
| 动物实验操作用品 | |||
| 27G 导管 | VisualSonics | 请致电订购 | Vevo MicroMarker 尾静脉通路套管套装 |
| 酒精棉片 | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| 纱布海绵 (4" × 4" 16层 | Cardinal Health | 2913 | |
| 加热灯 | 摩根维尔科学公司 | HL0100 | |
| 异氟烷 | Henry Schein 动物健康 | 29404 | |
| 眼用软膏 | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| 手术胶带 | 3M | 1530-1 | |
| 组织采集 | |||
| 一次性底模 | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| 外科手术伦敦镊子 | 精细科学工具 | 11080-02 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 抗体 | |||
| AlexaFluor-488 山羊抗大鼠 IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 山羊抗兔 IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 山羊抗人 IgG | Life Technologies | A11014 | |
| 人源IgG同型对照 | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| 人源化抗净素-1抗体 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| 兔抗小鼠 CD276（B7-H3） | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 克隆 |
| 大鼠抗小鼠 CD31 | BD 生物科学 | 550274 | MEC 13.3 克隆 |
| 试剂 | |||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| 透明指甲油 | 任何当地的药店 | ||
| 吲哚菁绿-NHS | Intrace Medical | ICG-NHS 酯 | |
| 封片剂 | 赛默飞世尔科技 | TA-006-FM | |
| 正常山羊血清 | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 材料与试剂 | |||
| 粘附玻璃载片 | VWR | 48311-703 | |
| 脱盐柱 | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| 玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544G | |
| 疏水屏障笔 | Ted Pella | 22311 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 载玻片染色架 | VWR | 87000-136 | |
| 软件 | |||
| FIJI | LOCI，威斯康星大学麦迪逊分校 | 版本 4.0 | https://fiji.sc/ |
