一种基于微珠的多重免疫测定法，用于鉴定唾液中的病原体特异性抗体

Abstract

来源:Augustine， S. A. J.， et al. 开发一种唾液抗体多重免疫测定法来测量人类对环境病原体的暴露情况。 J. Vis. Exp. （2016 年）。

该视频演示了一种基于微珠的多重免疫分析技术，可同时检测人唾液中多种环境病原体的抗体。荧光珠与来自不同病原体的抗原偶联，这些抗原使用人唾液样本中的抗体捕获。使用荧光报告基因标记抗体后，使用流式细胞术分析微珠，以评估唾液中是否存在不同的病原体特异性抗体。

Protocol

1. 珠子耦合

1. 使用表 1 中所示的浓度将抗原偶联到微珠组上。
2. 将每种抗原添加到活化的磁珠中，并在 50 mM MES（pH 5.0）中使总体积达到 500 μl。通过涡旋混合抗原和珠子。
3. 将抗原和微珠孵育 2 小时，并在室温下避光旋转混合 （~15 rpm）。通过以 10,000 x g 的微离心 2 分钟使偶联的珠子沉淀。
4. 去除上清液，通过涡旋和超声处理，将珠子重悬于 500 μl 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） - 牛血清白蛋白 （BSA） - 聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯 （Tween-20） - 叠氮化钠 （PBS-TBN） pH 7.4 中。通过以 10,000 x g 的微离心 2 分钟使珠子沉淀，并去除上清液。
   谨慎:叠氮化钠是一种剧毒化学品。如果吞咽或与皮肤接触是致命的。请勿吸入灰尘/烟雾/气体/薄雾/蒸气或喷雾。根据相关法律处理和处置设备时，应佩戴适当的个人防护设备 （PPE）。
5. 通过涡旋和超声处理将珠子重悬于 1 ml PBS-TBN 中 20 秒。
6. 通过以 10,000 x g 的微离心 2 分钟使珠子沉淀。
7. 重复步骤 1.5 和 1.6.
   注意:这提供了总共两次 PBS-TBN 洗涤。
将
8. 偶联和洗涤的珠子重悬于 1 ml PBS、1% BSA、0.05% 叠氮化物（pH 7.4）中。将偶联珠子储存在 2-8 °C 冰箱中避光。

2. 唾液多通路免疫测定

1. 从 -80 °C 冰箱中取出唾液，并在室温下解冻。
2. 通过涡旋和超声处理重悬抗原偶联的微珠原液 20 秒。
3. 通过在 PBS-1% BSA 缓冲液中将偶联的珠子原液稀释至最终浓度为 100 个珠子/μl 的每种独特珠子组来制备工作珠混合物。
4. 在 96 孔深孔板中用 PBS-1% BSA 缓冲液制备 1:4 稀释的唾液。
5. 用 100 μl 洗涤缓冲液预润湿滤板，并通过真空除去上清液。
6. 将 50 μl 工作珠混合物和等体积的稀释唾液添加到 96 孔滤板的 95 个孔中，以 1:8 的最终稀释度。使用多通道移液器混合反应。向一个对照孔中，加入 50 μl 抗原偶联珠子和 50 μl PBS-1% BSA 缓冲液（作为唾液的替代品）。
7. 盖上盖子，在室温下在微孔板振荡器上以 500 rpm 的转速避光孵育 1 小时。通过真空去除上清液。用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤孔，并通过真空除去上清液。重复洗涤 1 次。
8. 用多通道移液器将珠子重悬于 50 μl PBS-1% BSA 中。
9. 在 PBS-1% BSA 中将生物素化山羊抗人 IgG 二级检测抗体稀释至 16 μg/ml。
10. 向每个孔中加入 50 μl 稀释的二抗，并用多通道移液器混合内容物。
11. 盖上滤板，使其在室温下在板振荡器上避光孵育 30 分钟。通过真空去除上清液。用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤孔，并通过真空除去上清液。重复洗涤 1 次。
12. 用多通道移液器将珠子重悬于 50 μl PBS-1% BSA 中。
13. 在 PBS-1% BSA 中将链霉亲和素-R-藻红蛋白报告基因 （SAPE） 稀释至 24 μg/ml。
14. 向每个孔中加入 50 μl 报告基因，并与多通道移液器混合。
15. 盖上滤板，使其在室温下在板振荡器上避光孵育 30 分钟。通过真空去除上清液。用 100 μl 洗涤缓冲液洗涤孔，并通过真空除去上清液。重复洗涤 1 次。
将
16. 珠子重悬于 100 μl PBS-1% BSA 中，并使用分析仪分析 50 μl。
    注意:多重免疫测定的结果以中位荧光强度 （MFI） 单位测量。请始终参考最新版本的软件手册（如果有），以避免错误。

表 1:用于多重免疫测定的工作磁珠混合物。完成偶联和确认后，如图所示制备由每个微珠组组成的预混液。将预混液分布在 96 孔板的所有孔中。所有孔均与唾液一起孵育，但一个背景对照孔除外，该孔仅包含珠子和 PBS-1% BSA 缓冲液。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 抗原 珠组 偶联缓冲器 Ag 浓度 （μg） # 1 个角的珠子 # 珠子/μl 体积 （100 B/uL） 4 ml （μl） C. jejuni 空肠梭菌 8 制造执行委员会 5.0 50 64 6,400 人 94 幽门螺杆菌 33 制造执行委员会 5.0 25 71 7,100 85 元 甲型肝炎 42 制造执行委员会 5.0 100 91 9,100 66 弓形虫 30 制造执行委员会 5.0 25 85 元 8,500 71 诺如病毒 GII.4 55 元 制造执行委员会 5.0 5 72 7,200 人 83 诺如病毒 GI.1 67 制造执行委员会 5.0 5 63 6,300 人 95 元 解耦 80 制造执行委员会 5.0 60 6,000 100 珠子总体积 （μl） 594 元 所需缓冲液总体积 （μl） 3,406

Materials