来源：Augustine, S. A. J.， 等 开发唾液抗体多重免疫测定法以检测人类对环境病原体的暴露情况。 J. Vis. Exp. (2016)。
本视频演示了一种基于微球的多重免疫检测技术，用于同时检测人唾液中针对多种环境病原体的抗体。将来自不同病原体的抗原偶联到荧光微球上，这些抗原可被唾液样本中的特异性抗体捕获。随后使用荧光标记物对结合的抗体进行标记，并通过流式细胞术分析微球，以评估唾液中各类病原体特异性抗体的存在情况。
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方法文章
一种基于微球的多重免疫分析法用于鉴定唾液中的病原体特异性抗体
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 微珠偶联
- 使用 表1 中所示的浓度将抗原偶联至微球组。
- 将每种抗原加入活化的微球中，并用50 mM MES缓冲液（pH 5.0）定容至总体积500 µl。通过涡旋混合抗原与微球。
- 室温避光条件下，以约15 rpm转速旋转孵育抗原与微球2小时。在10,000 × g条件下离心2分钟，使用微量离心机沉淀偶联后的微球。
- 弃去上清液，将微球重悬于500 µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）-牛血清白蛋白（BSA）-聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）-叠氮化钠（PBS-TBN）（pH 7.4）中，通过涡旋和超声处理混合。在10,000 × g条件下微量离心2分钟，沉淀微球后弃去上清液。
注意：叠氮化钠为急性毒性化学品，吞咽或皮肤接触可致死。避免吸入粉尘/烟雾/气体/雾气/蒸气或喷雾。操作和处置时应按照相关法规穿戴适当个人防护装备（PPE）。 - 通过涡旋和超声处理20秒，将微球重悬于1 ml PBS-TBN中。
- 在10,000 × g条件下微量离心2分钟，沉淀微球。
- 重复步骤1.5和1.6。
备注：此步骤共完成两次PBS-TBN洗涤。 - 将偶联并洗涤后的微球重悬于1 ml PBS（含1% BSA、0.05%叠氮化钠，pH 7.4）中。避光保存于2–8 °C冰箱中。
2. 唾液多重免疫测定
- 从 -80 °C 冰箱中取出唾液样本，在室温下解冻。
- 通过涡旋振荡和超声处理 20 秒，重悬抗原偶联的磁珠储备液。
- 将偶联磁珠储备液用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释，制备工作用磁珠混合液，使每种独特磁珠的终浓度为 100 个磁珠/µl。
- 在 96 孔深孔板中，用 PBS-1% BSA 缓冲液将唾液样本稀释 1:4。
- 用 100 µl 洗涤缓冲液预润湿滤板，通过真空抽吸去除上清液。
- 向 96 孔滤板的 95 个孔中各加入 50 µl 工作用磁珠混合液和等体积的稀释唾液，得到 1:8 的终稀释度。使用多通道移液器混匀反应体系。在对照孔中加入 50 µl 抗原偶联磁珠和 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液（代替唾液）。
- 盖上盖板，在黑暗条件下，于 500 rpm 的微孔板振荡器上室温孵育 1 小时。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液洗涤，再通过真空抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 用多通道移液器将磁珠重悬于 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液中。
- 将生物素标记的山羊抗人 IgG 二抗检测抗体用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释至 16 µg/ml。
- 向每孔加入 50 µl 稀释后的二抗，用多通道移液器混匀。
- 盖上盖板，在黑暗条件下，于板式振荡器上室温孵育 30 分钟。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液洗涤，再通过真空抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 用多通道移液器将磁珠重悬于 50 µl PBS-1% BSA 缓冲液中。
- 将链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子（SAPE）用 PBS-1% BSA 缓冲液稀释至 24 µg/ml。
- 向每孔加入 50 µl 报告分子溶液，用多通道移液器混匀。
- 盖上盖板，在黑暗条件下，于板式振荡器上室温孵育 30 分钟。通过真空抽吸去除上清液。每孔加入 100 µl 洗涤缓冲液洗涤，再通过真空抽吸去除上清液。重复洗涤一次。
- 将磁珠重悬于 100 µl PBS-1% BSA 缓冲液中，取 50 µl 使用分析仪进行检测。
注意： 多重免疫分析结果以中位荧光强度（MFI）为单位测定。如有最新版本的软件手册，请始终参考该手册以避免错误。
表1：多重免疫测定中使用的磁珠工作混合液。 在完成偶联与验证后，按所示方法制备包含每种磁珠集合的总混合液。将该总混合液分配至96孔板的所有孔中。除一个仅含磁珠和PBS-1% BSA缓冲液的背景对照孔外，其余各孔均加入唾液样本进行孵育。
| 抗原 | 微球编号 | 偶联缓冲液 | 抗原浓度 (µg) | 1个角落中的微球数 | 微球数/µl | 配制4 ml浓度为100 B/µl所需的体积 (µl) |
| C. jejuni | 8 | MES 5.0 | 50 | 64 | 6,400 | 94 |
| H. pylori | 33 | MES 5.0 | 25 | 71 | 7,100 | 85 |
| 甲型肝炎 | 42 | MES 5.0 | 100 | 91 | 9,100 | 66 |
| T. gondii | 30 | MES 5.0 | 25 | 85 | 8,500 | 71 |
| 诺如病毒 GII.4 | 55 | MES 5.0 | 5 | 72 | 7,200 | 83 |
| 诺如病毒 GI.1 | 67 | MES 5.0 | 5 | 63 | 6,300 | 95 |
| 未偶联微球 | 80 | MES 5.0 | 60 | 6,000 | 100 | |
| 微球总体积 (µl) | 594 | |||||
| 所需缓冲液总体积 (µl) | 3,406 | |||||
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器与软件 | |||
| 微量离心机 | Thermo Electron Corporation | 75002446 | 用于离心样品 |
| 涡旋混合器 | VWR | G560 | 用于混匀样品 |
| 超声波破碎仪（小型） | Fisher Scientific | 15-337-22 | 用于分散磁珠 |
| 移液器 P10、P20、P100、P1000、8通道 | Capp | Various | |
| 多孔板真空过滤装置（Multiscreen Vacuum Manifold） | Millipore | MSVMHTS00 | 洗涤步骤中用于去除上清液 |
| 微型振荡器（MicroShaker） | VWR | 12620-926 | 孵育过程中用于振荡磁珠 |
| 离心管架（1.5 mL 和 0.5 mL，多种规格） | VWR | 30128-346 | |
| 电子天平 | Mettler 或其他 | 用于称量洗涤试剂以配制缓冲液 | |
| Dynabead 样品混合器 | Invitrogen | 947-01 | 偶联孵育步骤中使用 |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | 用于分析抗体反应数据 | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | 用于分析抗体反应数据 | |
| Luminex 分析仪，配备 xPonent 3.1 软件 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | 用于运行检测的仪器及软件 |
| 抗原 | |||
| GI.1 诺如病毒：p-颗粒 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *辛辛那提儿童医院。终浓度 5 µg。 |
| GII.4 诺如病毒 VA387：p-颗粒 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *辛辛那提儿童医院。终浓度 5 µg。 |
| 甲型肝炎病毒：细胞培养来源的 II 级浓缩物 | Meridian Life Sciences | 8505 | 抗原偶联量为 100 µg |
| 幽门螺杆菌：裂解物 | Meridian Life Sciences | R14101 | 抗原偶联量为 25 µg |
| 弓形虫：重组 p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | 抗原偶联量为 25 µg |
| 空肠弯曲菌：热灭活全菌细胞 | KPL | 50-92-93 | 抗原偶联量为 50 µg |
| 一抗 | |||
| 豚鼠抗诺如病毒抗体 | (CCHMC)* | NA | 用于偶联验证 |
| 小鼠抗甲型肝炎 IgG 抗体 | Meridian Life Sciences | C65885M | 用于偶联验证 |
| 小鼠抗甲型肝炎 IgG 抗体 | Meridian Life Sciences | C65885M | 用于偶联验证 |
| BacTrace 幽门螺杆菌亲和纯化抗体 | KPL | 01-93-94 | 用于偶联验证 |
| 山羊多克隆抗体抗弓形虫 | Abcam | Ab23507 | 用于偶联验证 |
| BacTrace 山羊抗弯曲菌属抗体 | KPL | 01-92-93 | 用于偶联验证 |
| 二抗 | |||
| 生物素-SP-标记的驴抗山羊 IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | 用于偶联验证 |
| 生物素标记的兔抗山羊 IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | 用于偶联验证 |
| 生物素标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | 用于偶联验证 |
| 亲和纯化山羊抗兔 IgG(H+L) 生物素标记抗体 | KPL | 176-1506 | 用于偶联验证 |
| 亲和纯化山羊抗人 IgG(γ) 生物素标记抗体 | KPL | 16-10-02 | 用于唾液免疫检测 |
| 耗材 | |||
| 1.5 mL 共聚物微量离心管 | USA Scientific | 1415-2500 | 用作低吸附微量离心管 |
| 10 µL 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL 移液器吸头补充装 | BioVentures | 5130140C | |
| 铝箔 | Various Vendors | 孵育过程中用于遮蔽磁珠，避免光照 | |
| 深孔板 | VWR | 40002-009 | 用于稀释唾液样本 |
| 多孔滤膜板（Multiscreen Filter Plates） | Millipore | MABVN1250 | 用于运行检测 |
| Oracol 唾液采集系统 | Malvern Medical Developments Limited | 用于唾液采集 | |
| 试剂 | |||
| 羧基化微球（磁珠） | Luminex Corporation | Dependent on bead set | 抗原偶联至微球表面 |
| EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐） | Pierce | 77149 或 22980 | 用于磁珠活化 |
| Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐） | Pierce | 24510 | 用于磁珠活化 |
| 链霉亲和素-R-藻红蛋白（1 mg/mL） | Molecular Probes | S-866 | 用作报告分子 |
| MES（2-[N-吗啉代]乙磺酸） | Sigma | M-2933 | 用于偶联反应 |
| Tween-20（聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯） | Sigma | P-9416 | 用于洗涤缓冲液，以去除非特异性结合 |
| 蛋白缓冲液 | |||
| PBS-TBN 封闭/储存缓冲液（PBS，0.1% BSA，0.02% Tween-20，0.05% 叠氮化钠，pH 7.4）** | 过滤除菌后于 4°C 保存 | ||
| PBS，pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl，2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| 叠氮化钠（0.05% 叠氮化钠）** | Sigma | S-8032 | **注意：叠氮化钠具有急性毒性。避免接触皮肤和眼睛。佩戴适当的个人防护装备（PPE）。根据相关法规进行处置。 |
| MES/偶联缓冲液（0.05 M MES，pH 5.0） | |||
| MES（2-[N-吗啉代]乙磺酸） | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| 检测缓冲液（PBS，1% BSA，pH 7.4） | 过滤除菌后于 4°C 保存 | ||
| PBS，1% BSA，pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl，2.7 mM KCl，1% BSA |
| 活化缓冲液（0.1 M NaH2PO4，pH 6.2） | 过滤除菌后于 4°C 保存 | ||
| NaH2PO4（磷酸二氢钠，无水） | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| 洗涤缓冲液（PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4） | 过滤除菌后于 4°C 保存 | ||
| PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.05% TWEEN |
