定量流式细胞术检测人吞噬细胞对真菌孢子的吞噬作用

摘要

来源：Hartung, S.，等，利用流式细胞术检测人白细胞对烟曲霉分生孢子的吞噬作用。视觉化实验杂志（2019）

本视频展示了一种定量检测人白细胞吞噬FITC标记的致病性真菌孢子的方法。通过复染区分被吞噬的孢子与黏附在细胞表面的孢子，随后进行流式细胞术分析。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 吞噬作用检测

1. 在12孔细胞培养板中，将2 × 10⁶个白细胞与4 × 10⁶个FITC标记的分生孢子（感染复数 = 2）加入1.5 mL RPMI + 10% FCS中共同孵育。设置对照组：仅含细胞（无分生孢子）以及细胞加未标记分生孢子。
2. 置于37 °C、加湿的CO₂培养箱中，孵育所需时间（例如0.5 h、2 h或4 h）。
3. 孵育结束后，用细胞刮收集细胞，并转移至15 mL离心管中。
4. 室温下以300 × g离心5 min。
5. 收集上清液用于细胞因子分析，如不需要则弃去。将每份样品重悬于100 µL PBS + 2 mM EDTA中。

2. 抗体染色

1. 针对每个样本，根据表1配制100 µL抗体混合液，其中包含APC抗FITC抗体。
2. 将100 µL样本加入96孔V型底板的一个孔中。加入150 µL PBS + 2 mM EDTA进行洗涤。
3. 进行颜色补偿时，将每种荧光染料对应的1 × 10⁶个细胞分别加入96孔V型底板的其他孔中。设置一个不加染料的细胞孔作为阴性对照。每孔加入150 µL PBS + 2 mM EDTA进行洗涤。
4. 用粘性封板膜覆盖板孔。
5. 室温下以300 × g离心5分钟。取下封板膜。
6. 将板在水槽上方或一次性纸巾上快速有力地倒置一次，弃去上清液。
   注意：切勿重复倒置或敲击板至干燥，否则会导致细胞大量丢失。
7. 将细胞重悬于100 µL抗体混合液中，并通过移液充分混匀。
8. 进行颜色补偿时，将相应细胞重悬于100 µL PBS + 2 mM EDTA中，并向各孔分别加入与抗体混合液中相同剂量的单一抗体。
9. 用粘性封板膜覆盖，在室温避光条件下孵育20分钟。
10. 取下封板膜。每孔加入150 µL PBS + 2 mM EDTA进行洗涤。重新用粘性封板膜覆盖。
11. 室温下以300 × g离心5分钟。取下封板膜。将板在水槽或一次性纸巾上方快速有力地倒置，弃去上清液。
12. 将细胞重悬于200 µL PBS + 2 mM EDTA中，并将每孔细胞转移至独立的圆底离心管中。确保悬液中无细胞团块，如有则需去除。
    注意：任何肉眼可见的细胞团块均可能堵塞流式细胞仪。

3. 流式细胞术

1. 启动流式细胞仪并预热，同时启动采集软件。
2. 创建新的实验，并设置和标记样品。
3. 设置参数（FSC 250，SSC 250）以及荧光染料 FITC、APC、BUV395、V500 和 PerCP-Cy5.5 的检测器。
4. 补偿设置
   1. 打开补偿设置界面。
   2. 指定各个单独的荧光通道。
   3. 使用未染色或单染的对照细胞，调节PMT检测器电压，使所有事件均位于量程范围内。
   4. 每种对照至少记录 10,000 个事件。
   5. 利用补偿设置计算荧光染料之间的溢出，并将其应用于实验的流式细胞仪设置中。
5. 记录样品数据
   1. 在采集软件中显示 FSC 和 SSC，并在白细胞周围设置门控。
   2. 基于白细胞门控，显示 SSC/CD45 散点图，并对 CD45⁺ 细胞设门，以区分于分生孢子（conidia）。
   3. 将 CD45⁺ 细胞显示在 CD14/CD66b 散点图中，分别对单核细胞（CD14⁺）和中性粒细胞（CD66b⁺）设门。
   4. 将中性粒细胞显示在 anti-FITC/FITC 散点图中。
   5. 使用未标记分生孢子的样品，设置 anti-FITC 和 FITC 信号的象限，使各象限中细胞比例不超过 1%。
   6. 对单核细胞门重复步骤 3.5.4 和 3.5.5。
   7. 对所有样品进行记录，白细胞门内至少采集 20,000 个事件。

表1：流式细胞术用抗体混合物。每种试剂的用量以每份样品（1 × 10⁶ 个细胞）所需的微升（µL）表示。

试剂	每样本微升数 (µl)
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0.5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
anti-FITC APC	0.5
PBS + 2 mM EDTA	97
总计	100

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粘附箔	Brand	701367
细胞培养板，12孔	Greiner Bio-one	665180
流式细胞仪	BD Biosciences		LSR Fortessa II，激光器：488 nm（蓝色）、405 nm（紫色）、355 nm（紫外）和 640 nm（红色）
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	在 PBS 中浓度为 2 mM
异硫氰酸荧光素（FITC）	Sigma Aldrich	F3651-100MG	在 Na2CO3 /PBS 溶液中浓度为 0.1 mM
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	189012-014	不含钙，不含镁
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	61870010	RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充剂
数据采集与分析软件	BD Biosciences
V 型底板，96 孔	Brand	781601	未经处理的表面
甲醛	Carl Roth	PO87.3	Histofix