一种用于表征和定量哺乳动物应激颗粒的免疫荧光检测方法

摘要

来源：Aulas, A. 等，将细胞质焦点归类为哺乳动物应激颗粒的方法。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种用于表征和定量哺乳动物应激颗粒的实验方法，应激颗粒由mRNA、RNA结合蛋白（RBPs）以及多种其他蛋白质组成。

方案

1. 细胞准备

1. 按照 图1A 所示，将已灭菌的盖玻片加入24孔板的12个孔中；可使用连接真空装置的无菌巴斯德吸管逐个吸取盖玻片。轻轻将盖玻片在孔壁上轻敲，释放负压，使盖玻片落入孔底。
2. 每孔接种1 × 10⁵ 个U-2 OS（U2OS）骨肉瘤细胞，终体积为500 µL培养基。将培养板左右、上下轻轻晃动数次，确保细胞均匀分布。
3. 用洁净的P1000枪头轻轻按压盖玻片，确保盖玻片完全贴于孔底，且其下方无气泡。

2. 细胞应激处理

1. 次日，使用倒置组织培养显微镜配合10倍物镜目视检查培养板，确保细胞在盖玻片上分布均匀且融合度一致，因为样品间的差异可能对实验结果的可重复性产生不利影响。
2. 将培养基预热至37 °C。避免向细胞中添加过冷或过热的培养基，以免分别引起冷休克或热休克。
3. 用预热的培养基稀释药物。针对每种不同的药物浓度，准备2个含有500 µL培养基的孔，并额外准备500 µL以补偿移液过程中的损耗。分装4个离心管，每管含1.5 mL。
   1. 对于亚砷酸钠：向每个含500 µL培养基的孔中加入1.5 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：100 µM），或加入0.75 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：50 µM）。
   2. 对于长春瑞滨：向每个含500 µL培养基的孔中加入22.5 µL的10 mM长春瑞滨（终浓度：150 µM），或加入18.75 µL的10 mM长春瑞滨（终浓度：100 µM）。
      注意：亚砷酸钠是一种已被充分表征且常用的压力颗粒诱导剂，因此通常作为阳性对照使用。
4. 移除并弃去B1–4和C1–4孔中的培养基。加入含药物的培养基，孵育60分钟（图1A）。
   1. 向B1和B2孔中各加入500 µL含100 µM亚砷酸钠的培养基；向B3和B4孔中各加入500 µL含50 µM亚砷酸钠的培养基。
   2. 向C1和C2孔中各加入500 µL含150 µM长春瑞滨的培养基；向C3和C4孔中各加入500 µL含125 µM长春瑞滨的培养基。
5. 在固定前30分钟，向第2列的孔中加入5 µL环己酰亚胺（1 mg/mL母液），向第4列的孔中加入2 µL嘌呤霉素（1.25 mg/mL母液）。轻轻摇动培养板以混匀，然后将培养板放回37 °C培养箱中继续孵育。

3. 细胞固定与免疫荧光

注意： 实验前，确保甲醇已冷却至 -20 °C。配制缓冲液，包括磷酸盐缓冲液（PBS）、含 5% 正常马血清（NHS）的 PBS，以及含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。

1. 弃去培养基，用 PBS 洗涤含有盖玻片的孔板。根据所使用的药物，妥善处理含药物的培养基可能至关重要；请联系当地环境安全办公室获取具体操作指引。为实现有效洗涤，可将 PBS 装入挤压瓶中，剪去瓶口尖端，以使液体流出更温和、不形成强力射流，每次吸除原有 PBS 后，用此装置向各孔加入 PBS。
2. 使用约 250 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）在室温（RT）下轻柔振荡固定细胞 15 分钟。确保盖玻片表面完全被 PFA 覆盖；250 µL 通常足够，若不足可适量补充。切勿将移液枪头直接对准盖玻片滴加液体，因为某些细胞（或经应激处理的细胞）的贴壁能力可能发生变化，移液时的液流冲击力可能导致细胞脱落。
3. 移除PFA并妥善处理。有关如何正确丢弃多聚甲醛的详细信息，请联系当地环境安全办公室。
4. 加入约 250 µL 甲醇（-20 °C），在室温下轻轻摇动孵育 5 分钟；此步骤可同时实现细胞通透化并使细胞展平。
5. 移除并弃去甲醇，随后加入约 250 µL 的 5% NHS，在室温下封闭 1 小时，或在 4 °C 过夜（O/N）。有关甲醇的正确处置方法，请咨询当地环境安全办公室。
6. 对于一抗，使用5% NHS稀释抗体。
   注意： 使用多种应激颗粒（SG）标记物是确认所观察到的颗粒是否为应激颗粒的关键 真正有效的 SGs。可使用的SG标记物数量取决于显微镜配备的滤光片。若具备标准的绿色、红色和远红滤光片组，请使用G3BP1、eIF4G和eIF3b，稀释比例为1/250。
   1. 本实验共使用12个盖玻片，每个250 µL（总计：3 mL 5% NHS），分别加入12 µL以下抗体：anti-G3BP1、anti-eIF3b 和 anti-eIF4G。在室温下轻轻振荡孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。
7. 用 PBS 洗涤各孔 3 次，每次孵育 5 分钟。
8. 对于二抗，将所有二抗（1:250稀释）和Hoechst染料（1:1,000稀释）用5% NHS稀释。
   1. 本实验共需12个盖玻片，每个250 µL，总计3 mL 5% NHS。加入下列试剂各12 µL：Cy2-小鼠、Cy3-兔、Cy5-山羊（均为1/250稀释），并加入Hoechst染料3 µL。
   2. 将盖玻片与二抗在室温下孵育1小时。在此步骤及后续步骤中，通过用盒子覆盖培养板或在组织培养皿上方覆盖铝箔，避免样品暴露于光线下。
9. 用 PBS 洗涤各孔，每次 5 分钟，共洗涤三次。
10. 将盖玻片用封片剂固定在已标记的玻璃载片上。将封片剂置于37 °C加热块中加热10分钟，以降低其黏度，便于移液。使用剪去尖端的P200吸头，每张盖玻片滴加25 µL封片剂至载片上；每张载片可放置4–8张盖玻片，前提是显微镜载物台允许。用精细镊子将盖玻片从孔中转移至载片，确保细胞面朝下接触封片剂。使用洁净的P200吸头轻压盖玻片，使其固定。
11. 所有盖玻片封片完成后，使用折叠的实验室纸巾用力按压载玻片表面，以彻底清除多余的封片剂。使用装有 H 的挤压瓶₂用 O 冲洗掉多余的封片剂，然后用折叠的实验室纸巾再次吸去水分。

结果

图1：实验示意图。（A）将细胞接种至预先置于24孔板中的盖玻片上，如图所示。使用所示浓度（µM）的SA或VRB处理A行和B行，孵育60分钟。60分钟后，在含药物的培养基中加入CHX（第2列终浓度：20 µg/mL）或嘌呤霉素（第4列，20 µg/mL puromycin）。继续孵育30分钟，随后进行固定和染色。（B）盖玻片示意图，标明用于计数的成像区域。盖玻片被分为五个大致相等的区域，每个区域拍摄一张图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
U-2 OS	ATCC	ATCC®HTB-96™	- 通常写作 "U2OS" - 在 37 °C、5% CO₂ 条件下，使用含 10% FBS 的 DMEM 培养
杜氏改良伊格尔培养基	Corning	10-013-CV	- 缩写为 DMEM - 含 4.5 g/L 葡萄糖、丙酮酸盐和酚红 - 补充 10% FBS、10 mM HEPES 及青霉素/链霉素 - 使用前预热用于药物稀释 - 使用前预热用于药物稀释
胎牛血清	Sigma	F2442-500ml	- 缩写为 FBS - 用于培养基补充
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080	- 用于培养基补充
青霉素-链霉素	Sigma	P0781-100ml	- 用于培养基补充
24 孔板	Costar	3524
实验室擦拭纸	KIMTECH SCIENCE	34120	- 通常称为 "kimwipes"
细胞培养用盖玻片	Fisher Scientific	12-545-82	- 使用前高压灭菌 - 在细胞培养超净台中保持无菌
亚砷酸钠 ≥90%	Sigma	S7400-100G	- 通常称为亚砷酸钠，缩写为 SA - 以水溶解配制成 1 M 浓度，再稀释为 100 µM 工作液
长春瑞滨	TSZ CHEM	RS055	- 缩写为 VRB - 以水溶解至 10 mM
嘌呤霉素	Sigma	P9620	- 用于评估翻译水平（核糖体嘌呤霉素化） - 用于评估应激颗粒与活跃翻译的关联 - 以水稀释至 10 mg/mL
盐酸二氢依替米星水合物	Sigma	E2375	- 与嘌呤霉素联用以评估总体翻译水平 - 用于评估应激颗粒与活跃翻译的关联 - 以水稀释至 10 mg/mL
环己酰亚胺	Sigma	C4859	- 缩写为 CHX - 用于评估应激颗粒与活跃翻译的关联 - 以水稀释至 10 mg/mL
磷酸盐缓冲液	Lonza / VWR	95042-486	- 缩写为 PBS - 免疫荧光洗涤缓冲液
甲醛试剂级，结晶状	Sigma	P6148-500G	- 在通风橱中以热 PBS 配制 4% 溶液，搅拌至完全溶解 - 分装后可在 -20 °C 保存数月 - 具有危害性，需使用通风设备 - 应作为特殊废弃物处理
甲醇，ACS 级	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- 使用前预冷至 -20°C - 应作为特殊废弃物处理
正常马血清	Thermo Fisher Scientific	31874	- 缩写为 NHS - 以 PBS 稀释至 5% - 添加叠氮化钠后可在 4°C 下保存 - 用于免疫荧光封闭
乙醇，纯度 200 Proof (100%)，USP，KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- 以水稀释至 70%
Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片	Fisherbrand	12-550-15
小鼠抗 G3BP1 抗体 (TT-Y)	Santa Cruz	sc-81940	- 4 °C 保存 - 使用 1/100 稀释度
兔抗 eIF4G 抗体 (H-300)	Santa Cruz	sc-11373	- 4 °C 保存 - 使用 1/250 稀释度
山羊抗 eIF3η (N-20) 抗体	Santa Cruz	sc-16377	- eIF3η 也称为 eIF3b - 4 °C 保存 - 使用 1/250 稀释度
Cy2 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	715-225-150	- 按照制造商说明以水重悬后，4°C 保存 - 使用 1/250 稀释度
Cy3 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-165-152	- 按照制造商说明以水重悬后，4°C 保存 - 使用 1/2500 稀释度
Cy5 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	705-175-147	- 按照制造商说明以水重悬后，4°C 保存 - 使用 1/250 稀释度
Hoechst 33258 溶液	Sigma	94403-1ML	- 与二抗同时孵育——母液为 0.5 mg/mL 的 dH₂O 溶液，避光保存——4 °C 保存
20 x SSC 缓冲液	Thermo fisher Ambion	AM9763	- 使用无 RNase 水（DEPC 处理）稀释至 2X SSC——室温保存——FISH 实验洗涤缓冲液
封片介质	自制	/	- 将 5 g "冷水可溶" 聚乙烯醇 (PVA) 加入 20 ml PBS 中——超声混合，随后室温搅拌过夜——加入 5 ml 甘油和 0.2 ml 20% 叠氮化钠，室温搅拌 16 小时——20,000 g 离心 20 分钟，弃去大颗粒沉淀——分装黏稠液体，长期储存于 -20°C，4°C 可保存 1 周
Parafilm "M"	Sigma	P7793-1EA	- 通常称为 "parafilm"
聚乙烯醇	Sigma	P-8136-250G	- 用于制备 vinol
甘油	Sigma	G5516-100ML	- 用于制备 vinol
叠氮化钠	Fisher Scientific	S2002-5G	- 用于封闭液和 vinol 的防腐剂 - 以水配制成 20% 溶液