一种评估粒细胞和单核细胞吞噬作用与氧化爆发活性的检测方法

摘要

来源：Meaney, M. P. 等，测量人血液中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发活性。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了用于确认人血细胞吞噬活性的实验方法 通过 流式细胞术。粒细胞和单核细胞分别通过显示绿色和红色荧光来证实其吞噬活性，绿色荧光表明吞噬了细菌，红色荧光表明存在氧化爆发活性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 检测准备

1. 收集、准备并整理该实验步骤所需的材料（详见特定材料/设备列表）。
   1. 标记 12 x 75 mm 试管。
      1. 为每位参与者标记两个试管：一个用于吞噬作用检测（用黑色墨水标记，并标注“F”，代表异硫氰酸荧光素 [FITC]），另一个用于氧化爆发（OB）活性检测（用红色墨水标记，并标注“H”，代表二氢乙啶 [HE]）。      
         注意： 建议使用无菌的12 x 75 mm试管，以尽量减少非预期的细胞活化及相关背景噪声的升高。
      2. 为检测对照标记三支试管：一支用于吞噬作用检测（FITC对照：用黑色墨水标记并标注“F”），一支用于骨吸收活性检测（HE对照：用红色墨水标记并标注“H”），另一支用于阴性对照（仅血液：用绿色墨水标记并标注“血样仅含血液”）。
   2. 至少在实验前一天配制储备液。
      1. 配制无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。将100 ml的10倍浓度PBS与900 ml的18.2 MΩ H₂O混合稀释。₂O. 使用0.2 µm滤器过滤除菌，4 °C保存备用。
      2. 制备无菌PBS葡萄糖溶液。将1.0 g葡萄糖溶解于100 ml PBS中，使用0.2 µm滤器过滤除菌。4 °C保存备用。
      3. 配制无菌的 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液。将 1.2 g 柠檬酸和 1.1 g 柠檬酸钠溶解于 100 ml 18.2 MΩ H₂O 中。₂O. 调节pH至4.0，用0.2 µm滤器过滤除菌，4 °C保存备用。
      4. 配制HE储备液。将1.0 mg HE溶解于1.0 ml二甲基亚砜（DMSO）中，轻轻混匀，分装后于-20 °C保存备用。
      5. 制备FITC标记的 金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 原液 (2 x 10⁹ 颗粒/毫升）。重悬10 mg FITC标记的 S. aureus 在1.5 ml（或适量）PBS中溶解，分为三份，每份500 µl，按制造商推荐条件进行超声处理。分装后于-20 °C保存，直至使用。
      6. 制备未标记的 S. aureus 储存液（2 ×10⁹ 颗粒/毫升）。重悬100 mg未标记的 S. aureus 在15 ml（或适量）PBS中，分装为三十份，每份500 µl，按照制造商推荐条件进行超声处理。分装后于-20 °C保存，直至使用。
   3. 在检测当天配制新鲜的工作液。
      1. 配制HE工作液。将10 µl解冻的HE储备液加入990 µl PBS-葡萄糖溶液中，避光并置于冰上保存，直至使用。
      2. 制备FITC标记的 S. aureus 工作溶液（133,333 粒子/µl）。转移 70 µl 解冻后的 FITC 标记 S. aureus 将储备液加入980 µl PBS中。避光并置于冰上保存，直至使用。
      3. 制备未标记的 S. aureus 工作溶液（133,333 粒子/µl）。转移 70 µl 解冻后的未标记溶液 S. aureus 将储备液加入980 µl PBS中。避光并置于冰上保存，直至使用。
      4. 配制淬灭溶液。将750 µl的0.4%台盼蓝溶液加入11.25 ml无菌0.1 M柠檬酸缓冲液中。使用前置于冰水浴中保存。
   4. 由经认证的采血员按照世界卫生组织的采血指南采集血液。
      1. 将血液抽入一支含有4 ml乙二胺四乙酸二钾（K₂EDTA）的采血管中。₂EDTA）。根据制造商的说明颠倒混匀采血管。将采血管置于室温下的台面摇床上，直至使用。使用该血液进行1.2.1步骤中所述的白细胞（WBC）分类计数的全血细胞计数（CBC）。
      2. 将血液吸入一支含有锂肝素的4 ml采血管中。按照制造商说明颠倒混匀采血管。将采血管置于室温（RT）下的台式摇床上，直至使用。此血液用于步骤2中所述的单核细胞和粒细胞吞噬作用及OB活性检测。
2. 确定细菌数量（即, S. aureus完成每个样本检测所需的量。
   1. 使用血细胞分析仪，按照制造商说明书所述对血液进行全血细胞计数（CBC）并同时完成白细胞分类分析。记录白细胞计数（单位：个/毫升）、中性粒细胞百分比（%Neutrophil）和单核细胞百分比（%Monocyte）的数值。
   2. 使用以下公式计算每个样本的中性粒细胞和单核细胞数量。        
      中性粒细胞计数（细胞/毫升）= 中性粒细胞百分比 × 白细胞计数（细胞/毫升）
      单核细胞计数（细胞/毫升）= 单核细胞百分比 × 白细胞计数（细胞/毫升）
   3. 使用以下公式计算每个样本的吞噬细胞数量以及每100 µl样本中吞噬细胞的数量。
      吞噬细胞计数（细胞/ml）= 中性粒细胞计数（细胞/ml）+ 单核细胞计数（细胞/ml）  
      100 µl 中的吞噬细胞数量 = （吞噬细胞计数（个/ml））/10
   4. 使用以下公式确定细菌数量（即, S. aureus) 每个样本所需的量以及FITC标记的 S. aureus 或未标记 S. aureus 工作溶液（133,333 粒子/ml），应加入每支试管中。     
      注意： 靶细菌与吞噬细胞的比例为8:1。
      所需细菌数量 = 100 µl 中吞噬细胞数量 × 8
      所需 FITC 或未标记工作溶液的体积（µl）=（所需细菌数量）/（133,333 粒子/µl）

2. 进行检测

1. 为检测准备全血。
   1. 对于每位受试者和对照管，使用加长型移液器吸头将100 µl全血从锂肝素采血管转移至适当标记的12 x 75 mm试管底部。盖上管盖。
      注意：注意避免血液沾到12 x 75 mm试管的管壁上。
   2. 使用微量移液器向用红色墨水标记并标有“H”的试管（包括HE对照管）中加入10 µl HE工作液。盖上管盖后短暂涡旋混匀。
   3. 将所有试管置于37 °C水浴中孵育15分钟，随后立即转移至冰水浴中孵育12分钟。
      注意：使用开放式金属架，并每隔5分钟轻轻摇动一次，以确保试管迅速且充分地升温或冷却。
2. 向样本管和对照管中加入细菌（即， S. aureus）。
   1. 使用微量移液器向用红色墨水标记并标有“H”的试管（包括HE对照管）中加入适量（在步骤1.2.4中计算得出）未标记的 S. aureus 工作液。盖上管盖后短暂涡旋混匀。
   2. 使用微量移液器向用黑色墨水标记并标有“F”的试管（包括FITC对照管）中加入适量（在步骤1.2.4中计算得出）FITC标记的 S. aureus 工作液。盖上管盖后短暂涡旋混匀。
   3. 涡旋“仅血液”对照管，但不向其中加入任何类型的细菌（即， S. aureus）。
   4. 将所有试管置于37 °C水浴中孵育20分钟。使用开放式金属架，并每隔5分钟轻轻摇动一次，以确保试管迅速且充分地升温。孵育结束后，立即将所有试管转移至冰水浴中孵育1分钟。
3. 洗涤细胞。
   1. 使用多通道移液器向所有试管中加入100 µl预冷的淬灭液。盖上管盖，短暂涡旋混匀，随后将所有试管置于冰上孵育1分钟。
   2. 使用多通道移液器向所有试管中加入1 ml预冷的PBS。短暂涡旋混匀后，再向所有试管中加入额外2 ml预冷的PBS，并盖上管盖。在4 °C、270 x g条件下离心5分钟，随后吸除上清液。
   3. 重复步骤2.3.2一次（共洗涤2次）。
4. 准备流式细胞术样品。
   1. 使用多通道移液器向所有试管中加入50 µl预冷的胎牛血清。短暂涡旋所有试管。
   2. 将所有试管转移至合适的转盘中，并使用配备红细胞（RBC）裂解液和白细胞（WBC）固定液的自动化细胞裂解制备工作站，按照制造商说明书进行红细胞裂解和白细胞固定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 x 75 mm 带盖试管	VWR	20170-579	每个样本需要 2 支试管（"H" 和 "F"），每批次还需额外 3 支试管（用于检测对照；"F"、"H" 和 "仅血液"）。
PBS (10X)，pH 7.4	Life Technologies	70011-044
瓶顶式 0.2 µm 醋酸纤维素滤器（500 ml 容量）	Fisher Scientific	09-741-07
葡萄糖，粉末	Life Technologies	15023-021
柠檬酸（无水，经细胞培养测试，植物细胞培养测试）	Sigma-Aldrich	C2404-100G
三水合柠檬酸钠二水合物	Sigma-Aldrich	S4641-25G
二氢乙啶（羟乙啶）（HE）	Life Technologies	D11347
二甲基亚砜（DMSO）无水	Life Technologies	D12345
金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，荧光素偶联物（FITC）	Life Technologies	S2851
金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，未标记	Life Technologies	S-2859
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250-061
4.0 mL 真空采血管，含 7.2 mg 喷雾干燥 K2EDTA	VWR	BD367861	每个样本需要 1 支 K2 EDTA 血液采集管。
4.0 mL 真空采血管，含 68 USP 单位喷雾涂层锂肝素	VWR	BD367884	每个样本需要 1 支锂肝素血液采集管。
COULTER Ac·T 5diff CP	Beckman Coulter	6605705	即血细胞分析仪
COULTER Ac·T 5diff Rinse	Beckman Coulter	8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix	Beckman Coulter	8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse	Beckman Coulter	8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse	Beckman Coulter	8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal 校准品	Beckman Coulter	7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus	Beckman Coulter	7547198
AcT 5diff 稀释液	Beckman Coulter	8547169
200 µL 加长移液器吸头	VWR	37001-526
带隔热层的冰盒	VWR	89198-980	用于冰水浴。
开放式金属试管架	VWR	60916-702
胎牛血清	Life Technologies	26140-111
TQ-Prep 工作站	Beckman Coulter	6605429	即自动化细胞裂解制备工作站
ImmunoPrep 试剂系统	Beckman Coulter	7546999	即红细胞裂解/白细胞固定试剂系统
COULTER CLENZ	Beckman Coulter	8546929