人类黏膜衬液中免疫介质水平的定量分析

摘要

来源：Wolsk, H. M. 等，通过无创取样获取黏膜衬液以定量体内上呼吸道免疫介质水平 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了新生儿人鼻黏膜衬液提取物中免疫介质水平的定量检测。基于电化学发光的多重检测系统通过评估这些介质被激发时发射光的强度来测定其含量。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 实验设置

1. 使用滤纸片（纤维素羟基聚酯片，参见 材料表）。
   1. 对于1个月大的婴儿，裁剪成3 mm × 15 mm大小的条状；对于年龄较大的儿童和成人，则裁剪成L形（5 mm × 20 mm × 10 mm（L形短臂））。
2. 使用镊子将一片滤纸插入婴儿的每个鼻孔中。将滤纸置于下鼻甲前部（新生儿约插入鼻孔内1 cm，其他年龄段约1.5 cm）。
   1. 让新生儿平躺在床上，并给予糖水以安抚。
      注意： 对于其他年龄段的儿童，采样时让受试者坐在椅子上操作最为方便。
   2. 对于年龄较大的儿童，将L形滤纸的长臂插入每个鼻孔中。
3. 在鼻孔周围使用鼻夹，以减轻不适并防止滤纸意外脱落。
4. 在吸收2分钟后取出滤纸。
5. 将滤纸放入标记好的试管中，并立即在-80 °C下冷冻保存。
6. 记录采样当天儿童出现的任何呼吸道感染症状。
7. 记录在2分钟采样期间发生的任何打喷嚏、持续哭闹或鼻出血情况。

2. 气道免疫介质的定量分析

1. 从冰箱中随机取最多10个样本。记录样本编号。整个操作过程中将样本保持在冰上。
2. 冰上解冻后，将来自两个鼻孔的滤纸（每位受试者）浸入300 µL新配制的缓冲液中（见 材料表），缓冲液中每25 mL含一片完整的蛋白酶抑制剂片剂（见 材料表）。
   1. 根据滤纸大小调整缓冲液体积。
      1. 对于尺寸为3 × 15 mm的滤纸，使用300 µL缓冲液。
      2. 若仅有一个滤纸，则使用一半体积的缓冲液（150 µL）。
3. 将样本转移至板式振荡器（400 rpm）中振荡5分钟。使用计时器控制时间。
4. 将湿润的滤纸和检测缓冲液转移至置于微量离心管内的醋酸纤维素滤管（孔径0.22 µm）中（见 材料表）。
5. 在预冷的离心机（4 °C）中以16,000 × g离心5分钟，以获得管中的过滤鼻腔提取物。
6. 取出滤管，并在将鼻腔提取物分装至低蛋白结合储存板的孔中时，将离心管保持在冰上（见 材料表）。
7. 分装后储存于-80 °C，直至分析。
8. 使用高灵敏度、基于电化学发光的多重阵列系统测定鼻腔提取物中细胞因子和趋化因子的浓度（见 材料表）。
   c： 本研究进行了人源10重T_H1/T_H2细胞因子检测、9重趋化因子检测，以及单重白细胞介素-17A（IL-17A）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）检测。
   1. 检测时，将鼻腔提取物在4 °C下孵育过夜。按照试剂盒制造商的标准操作流程进行检测（见 材料表）。
      注意： 所用免疫检测试剂（见 材料表）通常具有较高的检测动态范围，范围在1 至 10,000 pg/mL之间，部分检测可达100,000 pg/mL。这意味着所有样本可在相同稀释倍数下进行检测，从而避免因健康与患病受试者样本稀释倍数不同而带来的影响，这与其他类似免疫检测方法相比具有优势。所有细胞因子的最低检测限为1 pg/mL或更低，趋化因子的最低检测限在1 至 50 pg/mL之间。在1月龄婴儿中，98%的样本无法检测到TSLP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维状羟基聚酯片	Accuwik Ultra	SPR0730	滤纸
Milliplex 检测缓冲液	Millipore	L-AB	缓冲液
低蛋白结合储存板	Thermo Scientific	CLS8161	板
蛋白酶抑制剂	Roche	11873580001	Complete EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物
多点板读板仪	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
检测试剂盒	Mesoscale		人10重TH1/TH2细胞因子检测、9重趋化因子检测，以及单重IL-17A、TGF-β1和TSLP检测。相关说明可在www.mesoscale.com网站在线查阅