一种用于筛选蛋白酶蛋白水解活性的荧光生成型肽切割检测方法

摘要

来源：Jaimes, J. A., 等 一种用于筛选蛋白酶活性的荧光生成肽切割检测法：在冠状病毒刺突蛋白激活中的应用。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种利用荧光原性肽检测蛋白酶蛋白水解活性的分析方法。蛋白酶识别肽上的切割位点，将其切割并使淬灭基团与荧光基团分离，从而使其产生荧光发射。通过检测和分析荧光信号，评估不同肽变体的切割效率。

方案

1. 肽的设计与制备

1. 从公共数据库（如 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）或病毒病原体数据库（https://www.viprbrc.org））获取目标融合蛋白的序列。选择位于融合肽上游的蛋白酶识别位点，并包含该序列上下游各2-3个氨基酸。
2. 订购多肽时，在其N端修饰FRET荧光对中的7-甲氧基香豆素-4-基乙酰基（MCA），C端修饰N-2,4-二硝基苯基（DNP）。
   注意：多家供应商可提供此类修饰服务，价格和交货时间因供应商而异。此外，也存在其他类型的修饰，其灵敏度不同，需根据所用酶标仪的波长设置进行相应调整。
3. 根据生产商的建议，通过轻柔吹打的方式重新溶解多肽。例如，将多肽溶于70%乙醇中，终浓度为1 mM。
4. 若仅通过吹打难以充分溶解多肽，可选择将含有多肽及溶剂的离心管置于超声水浴中，直至完全溶解。
5. 将多肽分装至避光或耐光的离心管中，以防止荧光淬灭。分装体积宜小，以避免反复冻融（例如，100 µL）。分装后于-20°C保存。

2. 荧光酶标仪的准备

1. 打开酶标仪，等待自检完成。
2. 在连接的计算机上启动操作软件，并确保其与酶标仪已连接。
3. 打开温度设置，将温度设为 30 °C（或根据蛋白酶最佳活性所需的温度）。
4. 点击 控制 | 仪器设置 以配置实验参数。
5. 选择“动力学”模式。
6. 选择“荧光”检测模式。
7. 输入激发波长和发射波长：分别为 330 nm 和 390 nm。
8. 取消勾选自动截止（Auto Cut-off）。
9. 选择中等灵敏度（Medium，正常灵敏度）。
10. 设定检测运行时间为 1 小时，每 60 秒进行一次读数。
11. 设置首次读数前混匀 5 秒，每次读数前混匀 3 秒。
12. 选择需要读取的孔位并开始检测。

3. 准备检测

1. 通过计算每种成分的适当用量并加入来配制测定缓冲液。对于弗林蛋白酶（furin），配制含有100 mM HEPES、1 mM CaCl₂、1 mM 2-巯基乙醇和5% Triton X-100的缓冲液。对于胰蛋白酶（trypsin），使用标准的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。
   注意：10 mL或更少的体积已足够。根据测定中所用蛋白酶的不同，缓冲液成分有所变化。
2. 将缓冲液置于冰上冷却。
3. 将测定板放置在冰上，并在其下方垫一层薄金属板以增强冷却效果和稳定性。使用底部平坦、未经处理的实心黑色聚苯乙烯96孔板。
   注意：必须使用黑色板，以防止相邻孔之间的荧光“串扰”。
4. 根据先前发表的文献或实验数据，计算每个反应所需添加的蛋白酶适量。对于弗林蛋白酶，每个反应使用1个单位，相当于0.5 µL。对于胰蛋白酶，每个反应使用0.5 µL的160 nM TPCK处理的胰蛋白酶（TPCK trypsin）。
5. 每个样品在每次测定中设置3个技术重复，每份样品总体积为100 µL。
   注意：实验评估表明，在正常光照条件下或弱光条件下进行移液操作并无差异。然而，肽类样品不应长时间暴露于光线下。
6. 向每个孔中加入适量的测定缓冲液（如步骤3.1所述，为94.5 µL）。
7. 向每个孔中加入蛋白酶。对于弗林蛋白酶和TPCK胰蛋白酶，每个样品均加入0.5 µL。向6个孔（3个作为空白对照，3个作为肽对照）中加入0.5 µL缓冲液，而非相应的蛋白酶。
8. 除空白对照孔外，向其余各孔加入肽至终浓度为50 µM。此处加入5 µL肽，其配制方法见步骤1.3。在空白对照孔中则加入5 µL缓冲液代替肽。
   注意：最初测试了多种肽浓度与所述酶浓度的组合，以确保酶已被饱和。
9. 将板插入荧光酶标仪，点击开始。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多肽	Biomatik	N/A
Furin	NEB	P8077S
经TPCK处理的胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
Triton-X100	Sigma-Aldrich	X100
PBS	康宁	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Molecular Devices	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Molecular Devices	N/A
96孔板（实心黑色聚苯乙烯，平底，未处理）	Costar	3915
轻阻尼管	沃森实验室	131-915BL 或 131-915BR