一种用于筛选蛋白酶蛋白水解活性的荧光生成型肽切割检测方法

摘要

来源：Jaimes, J. A., 等 一种用于筛选蛋白酶活性的荧光生成肽切割检测法：在冠状病毒刺突蛋白激活中的应用。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种利用荧光原性肽检测蛋白酶蛋白水解活性的分析方法。蛋白酶识别肽上的切割位点，将其切割并使淬灭基团与荧光基团分离，从而使其产生荧光发射。通过检测和分析荧光信号，评估不同肽变体的切割效率。

方案

1. 肽的设计与制备

1. 从公共数据库（如 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）或病毒病原体数据库（https://www.viprbrc.org））获取目标融合蛋白的序列。选择位于融合肽上游的蛋白酶识别位点，并包含该序列上下游各2-3个氨基酸。
2. 订购多肽时，在其N端修饰FRET荧光对中的7-甲氧基香豆素-4-基乙酰基（MCA），C端修饰N-2,4-二硝基苯基（DNP）。
   注意：多家供应商可提供此类修饰服务，价格和交货时间因供应商而异。此外，也存在其他类型的修饰，其灵敏度不同，需根据所用酶标仪的波长设置进行相应调整。
3. 根据生产商的建议，通过轻柔吹打的方式重新溶解多肽。例如，将多肽溶于70%乙醇中，终浓度为1 mM。
4. 若仅通过吹打难以充分溶解多肽，可选择将含有多肽及溶剂的离心管置于超声水浴中，直至完全溶解。
5. 将多肽分装至避光或耐光的离心管中，以防止荧光淬灭。分装体积宜小，以避免反复冻融（例如，100 µL）。分装后于-20°C保存。

2. 荧光酶标仪的准备

1. 打开酶标仪，等待自检完成。
2. 在连接的计算机上启动操作软件，并确保其与酶标仪已连接。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多肽	Biomatik	N/A
Furin	NEB	P8077S
经TPCK处理的胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
Triton-X100	Sigma-Aldrich	X100
PBS	康宁	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Molecular Devices	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Molecular Devices	N/A
96孔板（实心黑色聚苯乙烯，平底，未处理）	Costar	3915
轻阻尼管	沃森实验室	131-915BL 或 131-915BR