一种用于筛选蛋白酶蛋白水解活性的荧光肽切割测定法

Abstract

来源:Jaimes， J. A.， et al. 用于筛选蛋白水解活性的荧光肽切割测定:冠状病毒刺突蛋白激活的应用。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了使用荧光肽筛选蛋白酶蛋白水解活性的检测方法。蛋白酶识别其在肽上的切割位点，将其裂解并将淬灭基团与荧光团分离，从而发射荧光。检测并分析荧光信号，以检查不同肽变体的切割效率。

Protocol

1. 设计和制备肽

1. 从 NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 或病毒病原体数据库 （https://www.viprbrc.org） 等公共数据库获取目标融合蛋白的序列。选择融合肽之前的蛋白酶识别位点，并在该序列的上游和下游包括 2-3 个氨基酸。
2. 订购肽时，在 N 端使用 FRET 对 7-甲氧基香豆素-4-基乙酰基 （MCA） 和 C 端的 N-2,4-二硝基苯基 （DNP） 对其进行修饰。
   注意: 一些供应商提供这些修改。价格和交货时间取决于所选供应商。然而，存在灵敏度不同的替代修饰，并且需要根据波长调整读板器。
3. 根据制造商的建议，轻轻上下移液，重悬肽。例如，将肽重悬于 70% 乙醇中至终浓度为 1 mM。
4. 或者，如果肽不能通过移液很好地重悬，则将含有肽和溶剂的试管加入超声浴中，直到其完全重悬。
5. 将肽分装到光润版管或抗性管中，以保护肽免于漂白。保持小等分试样大小，以避免多次冻融循环（例如 100 μL）。将等分试样储存在 -20°C。

2. 准备荧光读板器

1. 打开读板器并等待自检完成。
2. 打开所连接计算机上的作软件，并确保它已连接到读板器。

Materials