一种用于筛选蛋白酶蛋白水解活性的荧光肽切割测定法

摘要

来源:Jaimes， J. A.， et al. 用于筛选蛋白水解活性的荧光肽切割测定:冠状病毒刺突蛋白激活的应用。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频演示了使用荧光肽筛选蛋白酶蛋白水解活性的检测方法。蛋白酶识别其在肽上的切割位点，将其裂解并将淬灭基团与荧光团分离，从而发射荧光。检测并分析荧光信号，以检查不同肽变体的切割效率。

方案

1. 设计和制备肽

1. 从 NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 或病毒病原体数据库 （https://www.viprbrc.org） 等公共数据库获取目标融合蛋白的序列。选择融合肽之前的蛋白酶识别位点，并在该序列的上游和下游包括 2-3 个氨基酸。
2. 订购肽时，在 N 端使用 FRET 对 7-甲氧基香豆素-4-基乙酰基 （MCA） 和 C 端的 N-2,4-二硝基苯基 （DNP） 对其进行修饰。
   注意: 一些供应商提供这些修改。价格和交货时间取决于所选供应商。然而，存在灵敏度不同的替代修饰，并且需要根据波长调整读板器。
3. 根据制造商的建议，轻轻上下移液，重悬肽。例如，将肽重悬于 70% 乙醇中至终浓度为 1 mM。
4. 或者，如果肽不能通过移液很好地重悬，则将含有肽和溶剂的试管加入超声浴中，直到其完全重悬。
5. 将肽分装到光润版管或抗性管中，以保护肽免于漂白。保持小等分试样大小，以避免多次冻融循环（例如 100 μL）。将等分试样储存在 -20°C。

2. 准备荧光读板器

1. 打开读板器并等待自检完成。
2. 打开所连接计算机上的作软件，并确保它已连接到读板器。
3. 打开温度设置并将其设置为 30 °C（或蛋白酶最佳性能所需的温度）。
4. 单击 Control |Instrument Setup（仪器设置）以设置实验。
5. 选择 Kinetic （动态）。
6. 选择 Fluorescence（荧光）。
7. 输入激发波长和发射波长:分别为 330 nm 和 390 nm。
8. 取消选择 Auto Cut-off。
9. 选择 Medium， normal sensitivity （中等，正常敏感度）。
10. 为测定选择 1 小时的运行时间，并选择每 60 秒一次测量。
11. 在第一次测量前设置 5 秒混合，在每次测量前 3 秒
12. 选择要读取的孔并开始检测。

3. 准备检测

1. 通过计算每种成分的适当数量并添加来制备检测缓冲液。对于弗林蛋白酶，制备由 100 mM HEPES、1 mM CaCl₂、1 mM 2-巯基乙醇和 5% Triton X-100 组成的缓冲液。对于胰蛋白酶，使用标准磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液。
   注意:10 mL 或更小的体积就足够了。根据测定中使用的蛋白酶，缓冲液会有所不同。
2. 将缓冲液放在冰上冷却。
3. 将检测板放在冰上，下面有一块薄金属板，以支持冷却和稳定性。使用纯黑色聚苯乙烯 96 孔板，平底且未经处理。
   注意:必须使用黑色板来防止荧光从相邻孔"泄漏"。
4. 根据以前的出版物或实验数据计算每个反应要添加的蛋白酶的适当量。对于弗林蛋白酶，每个反应使用 1 个单位，相当于 0.5 μL。对于胰蛋白酶，使用 0.5 μL 的 160 nM TPCK 胰蛋白酶。
5. 每个样品每次检测制备 3 个技术重复，每个样品的总体积为 100 μL。
   注意:实验评估表明，移液是在正常光线条件下进行还是在昏暗的光线下进行，都没有区别。但是，肽不应长时间暴露在光线下。
6. 将适量的检测缓冲液（94.5 μL，如步骤 3.1 中所述）移液到每个孔中。
7. 将蛋白酶添加到每个孔中。对于弗林蛋白酶和 TPCK 胰蛋白酶，每个样品使用 0.5 μL。向 6 个孔中（空白对照 3 个孔，肽对照 3 个孔），加入 0.5 μL 缓冲液，而不是相应的蛋白酶。
在每个
8. 孔中加入肽至终浓度为 50 μM，空白对照除外。在这种情况下，按照步骤 1.3 中的说明制备移液管 5 μL 肽。向空白对照中加入 5 μL 缓冲液，而不是 peptide.
   注意:最初使用所述酶浓度测试几种浓度的肽，以确保酶饱和。
9. 将板插入荧光读板器，然后单击开始。

材料