利用功能化纳米抗体监测GFP标记的膜蛋白到达反式高尔基体网络的过程

摘要

来源：Buser, D. P., 等. 利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基体网络。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种研究功能化纳米抗体摄取及其逆行运输的方法，以了解其细胞内转运途径。通过引入放射性标记的硫酸盐，并结合分离与检测技术，该方法可用于研究货物蛋白的内吞摄取及其向反式高尔基网络的运输过程。

方案

1. 培养细胞对功能化纳米抗体的摄取（用于硫酸化分析）

1. 在细胞培养超净台中，将约400,000至500,000个稳定表达GFP标记报告蛋白的HeLa细胞接种于35 mm培养皿或6孔板中，使用含抗生素的完全培养基（DMEM培养基，补充10%胎牛血清（FCS）、100单位/毫升链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1.5 µg/mL嘌呤霉素）。
   注意： 如上所述，本文以稳定表达 EGFP-Calnexin、EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 的 HeLa 细胞为例进行说明。除稳定细胞系外，亦可使用瞬时转染的 HeLa 细胞。
2. 在37 °C、7.5% CO₂条件下孵育细胞过夜₂ 孵育以增殖。
   注意： 细胞在第二天应达到约80%的汇合度。
3. 吸除完全培养基，室温下用1×PBS洗涤2次，然后在37 °C、7.5% CO₂条件下用无硫酸盐培养基（SFM）饥饿细胞1 h₂ 培养箱
   注意： SFM 的制备方法是加入 10 mL MEM 氨基酸（50 倍浓缩液）、5 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、5 mL 维生素溶液（100 倍浓缩液）和 900 µL CaCl₂。₂·2H₂加入至 500 mL 的 Eagle 平衡盐....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GFP抗体	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	产品由SigmaAldrich销售，但由Roche生产
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich
胎牛血清（FCS）	Biowest
硫-35（以硫酸钠形式）	Hartmann Analytics	ARS0105	产品含有5 mCi
6孔板	TPP	92406
多聚甲醛（PFA）	Applichem	A3813
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Mini-Protean TGX 凝胶，4-20%，15孔	Bio-Rad	456-1096