利用功能化纳米抗体监测GFP标记的膜蛋白到达反式高尔基体网络的过程

摘要

来源：Buser, D. P., 等. 利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基体网络。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种研究功能化纳米抗体摄取及其逆行运输的方法，以了解其细胞内转运途径。通过引入放射性标记的硫酸盐，并结合分离与检测技术，该方法可用于研究货物蛋白的内吞摄取及其向反式高尔基网络的运输过程。

方案

1. 培养细胞对功能化纳米抗体的摄取（用于硫酸化分析）

1. 在细胞培养超净台中，将约400,000至500,000个稳定表达GFP标记报告蛋白的HeLa细胞接种于35 mm培养皿或6孔板中，使用含抗生素的完全培养基（DMEM培养基，补充10%胎牛血清（FCS）、100单位/毫升链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1.5 µg/mL嘌呤霉素）。
   注意： 如上所述，本文以稳定表达 EGFP-Calnexin、EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 的 HeLa 细胞为例进行说明。除稳定细胞系外，亦可使用瞬时转染的 HeLa 细胞。
2. 在37 °C、7.5% CO₂条件下孵育细胞过夜₂ 孵育以增殖。
   注意： 细胞在第二天应达到约80%的汇合度。
3. 吸除完全培养基，室温下用1×PBS洗涤2次，然后在37 °C、7.5% CO₂条件下用无硫酸盐培养基（SFM）饥饿细胞1 h₂ 培养箱
   注意： SFM 的制备方法是加入 10 mL MEM 氨基酸（50 倍浓缩液）、5 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、5 mL 维生素溶液（100 倍浓缩液）和 900 µL CaCl₂。₂·2H₂加入至 500 mL 的 Eagle 平衡盐溶液中。经 0.22 µm 滤器过滤后分装。
4. 在指定用于放射性工作的通风橱或工作台中，制备含有0.5 mCi/mL [³⁵S]的硫酸盐标记培养基³⁵S]硫酸钠盐于无血清培养基中。
   注意： 小心处理所有含放射性的溶液。仅可在指定的通风橱或工作台中操作。所有接触过放射性的材料（枪头、管子、培养板等）或洗涤缓冲液必须单独收集并专门处理。以下所有步骤（步骤1.5–1.18）均需如此操作。
5. 将VHH-2xTS用1×PBS稀释后加入硫酸盐标记培养基中，使其终浓度为2 µg/mL。
   注意： 作为对照，还需加入VHH-std或另一种不含TS位点的纳米抗体，以证明标记的特异性。
6. 将 SFM 替换为含有 0.5 mCi/mL [35S]硫酸盐和 2 µg/mL VHH-2xTS 的 0.7 mL 硫酸盐标记培养基，于 37 °C、7.5% CO₂ 条件下孵育细胞 1 小时₂ 用于放射性工作的专用培养箱
   注意： 根据计划进行的实验，需要调整纳米抗体硫酸化的时间。此外，为了确定反式高尔基网络（TGN）到达动力学，需进行不同时间的标记（例如，10分钟、20分钟、30分钟等）。
7. 移除标记培养基，用预冷的1×PBS在冷却板或冰上洗涤细胞2-3次。
8. 加入1 mL裂解缓冲液（含1% Triton X-100和0.5%脱氧胆酸钠的PBS），并添加2 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合液，于4 °C在摇床上孵育细胞10–15分钟。
9. 刮取裂解液并转移至1.5 mL离心管中，涡旋混匀裂解液，于4 °C在翻转摇床中孵育10–15分钟。
10. 通过在 10,000 x g 条件下离心制备去核裂解液 g 4 °C 下离心 10 分钟。
11. 使用一个新的1.5 mL离心管，制备20–30 µL镍珠悬液，并用1×PBS轻柔地以1,000 × g离心沉淀一次进行洗涤 g 1 分钟。
    注意： 除了镍珠外，还可以使用链霉亲和素珠（如果纳米抗体被生物素标记）或蛋白A珠结合针对纳米抗体表位（T7标签或HA标签）的IgG。
12. 将去核裂解液转移至含有镍珠的1.5 mL离心管中，于4 °C在翻转摇床中孵育1小时，以分离纳米抗体。取部分去核裂解液（50–100 µL），加入SDS上样缓冲液煮沸，用于后续总细胞相关纳米抗体、GFP报告蛋白及上样对照的免疫印迹分析。
13. 用1×PBS或裂解缓冲液轻柔地在1,000 × g条件下离心沉淀珠子，洗涤3次 g 1 分钟。
    注意： 为更严格地洗涤珠子，可在 PBS 或裂解缓冲液中加入 20 mM 咪唑。
14. 小心吸除珠子上的所有洗涤缓冲液，加入 50 µL 2x 上样缓冲液，在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
15. 将煮沸后的珠子样品全部上样至一块中型12.5% SDS-PAGE凝胶，按照标准PAGE方案电泳，直至指示染料（如溴酚蓝）迁移至分离胶底部。
    注意： 也可使用小型12.5% SDS-PAGE或预制梯度凝胶进行总细胞相关纳米抗体、GFP报告蛋白及上样对照的免疫印迹分析。
16. 用约 30 mL 固定液（含 10% 乙酸和 45% 甲醇的 ddH₂O 溶液）固定分离胶。₂室温下用去离子水清洗凝胶三次，每次约50 mL，每次1小时，然后准备凝胶干燥。
17. SDS-PAGE凝胶的干燥​
    1. 将固定好的凝胶小心地放置在拉伸的保鲜膜上，并用预先裁剪好的滤纸覆盖。
    2. 将凝胶连同滤纸一起朝下放置在干燥平台上，盖上真空盖，开启真空泵进行凝胶干燥。干燥时间为3-5小时。
    3. 移去保鲜膜，将干燥的凝胶放入配备磷屏的放射自显影盒中。
18. 使用磷屏成像仪进行放射自显影。按照制造商的说明进行操作。
    注意： 根据信号强度的不同，干燥的凝胶需要用磷屏曝光更长时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GFP抗体	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	产品由SigmaAldrich销售，但由Roche生产
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich
胎牛血清（FCS）	Biowest
硫-35（以硫酸钠形式）	Hartmann Analytics	ARS0105	产品含有5 mCi
6孔板	TPP	92406
多聚甲醛（PFA）	Applichem	A3813
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Mini-Protean TGX 凝胶，4-20%，15孔	Bio-Rad	456-1096