一种定量检测抗体介导的吞噬寄生虫感染红细胞的实验方法

摘要

来源：Quintana, M. d. P. 等，利用基于流式细胞术的检测方法测定自然获得的针对Plasmodium falciparum寄生虫的吞噬诱导抗体。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种基于流式细胞术的吞噬作用检测方法，涉及标记并经调理的颗粒 恶性疟原虫-单核细胞对感染红细胞的吞噬作用。流式细胞术检测到单核细胞内的荧光，证实通过吞噬作用成功识别了已包被的红细胞。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 寄生虫培养

注意：遵循当地关于人类病原体处理的法规。

1. 按照先前所述的标准方案，在寄生虫培养基中（参见材料表）维持Plasmodium falciparum寄生虫的培养。
2. 使用山梨醇处理，使寄生虫保持高度同步化，方法如前所述。
3. 为确保Plasmodium falciparum感染红细胞（IE）表面表达VAR2CSA，使用与蛋白G磁珠偶联的抗VAR2CSA抗体（例如PAM1.4抗体，一种交叉反应性人源单克隆VAR2CSA特异性IgG）进行多轮免疫磁珠分选。
   1. 简言之，将晚期滋养体阶段感染红细胞（trophozoite-IEs）与偶联抗VAR2CSA抗体的磁珠孵育，并利用磁铁进行阳性筛选。
   2. 将筛选后的寄生虫在培养中扩增数个周期，直至寄生率至少达到5%。
   3. 或者，也可按照先前所述方法，选择能够结合固定于塑料表面的CSA（VAR2CSA的受体）的寄生虫。
4. 为验证筛选后寄生虫表面的VAR2CSA表达，按先前所述方法进行流式细胞术分析。
   1. 简言之，使用用于磁珠分选的相同抗体（步骤1.3）标记晚期滋养体阶段感染红细胞，随后加入荧光标记的二抗。
   2. 通过流式细胞术检测感染红细胞表面的反应性。成功的抗体筛选通常可获得绝大多数寄生虫表达VAR2CSA的群体（≈80%）。
5. 进行吞噬作用实验时，使用纯化的中期至晚期滋养体阶段感染红细胞。采用磁性分离法进行纯化，方法如前所述。
   注意：为准确判断寄生虫所处阶段，需对血涂片进行吉姆萨染色，并通过光学显微镜观察。请遵循标准操作流程及形态学判读指南，如前所述。也可使用密度梯度介质进行晚期阶段的纯化，但根据我们的经验，其感染红细胞得率较低，因此更推荐使用磁性纯化方法。
   1. 进行磁性分离时，将寄生虫培养物（5-10%寄生率）在室温下以500 x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL寄生虫培养基中。
   2. 将寄生虫悬液加入与磁铁偶联的Claricep Flash Silica CS柱（参见材料表），使其缓慢流过柱体。由于含有疟色素（hemozoin），滋养体感染红细胞具有顺磁性，将滞留在柱体网格中。
   3. 用50 mL寄生虫培养基洗涤柱体，并用50 mL寄生虫培养基洗脱磁柱中的感染红细胞。
6. 将1.5.3步骤中洗脱的液体在室温下以500 x g离心10分钟。小心弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL寄生虫培养基中。
7. 使用血细胞计数板，计数感染红细胞数量（可通过光学显微镜识别为含有深色疟色素颗粒的红细胞）及总细胞数，以计算最终寄生率（感染红细胞所占百分比）。
   注意：仅使用纯度至少为80%（即80%为感染红细胞）的寄生虫样本。
8. 根据计划检测的血清/抗体样本数量，估算所需感染红细胞的总量，并相应扩大寄生虫培养规模。一个75 cm²培养瓶，含25 mL培养液、5%红细胞压积及5-10%寄生率，通常可提供足够进行完整96孔板实验所需的感染红细胞。对于完整板（42个样本加6个对照，均设复孔），至少需要1.5 mL浓度为3.3 x 10⁷ 个感染红细胞/mL的寄生虫悬液。

2. THP-1 细胞

注意：本实验使用 THP-1 细胞系。该单核细胞系来源于一名单核细胞白血病患者，可从美国模式培养物集存库（ATCC）购买。请按照供应商说明，在 THP-1 培养基中培养该细胞系（参见材料表）。

1. 常规维护时，将 THP-1 细胞培养起始密度设为 2–4 × 10⁵ 个细胞/mL，当细胞浓度达到 8 × 10⁵ 个细胞/mL 时进行传代。
   注意：细胞浓度不得超过 1 × 10⁶ 个细胞/mL，并记录传代次数。避免使用传代次数超过 25 代的细胞。THP-1 细胞系的平均倍增时间介于 19–50 小时之间。在开始吞噬实验前，应测定该批细胞的倍增时间，以便粗略估算待测血清样本数量所需的培养物体积（例如，若需检测一整块 96 孔板，需要 10 mL 浓度为 5 × 10⁵ 个细胞/mL 的细胞培养物）。
2. 定期检测 THP-1 细胞表面 Fcγ 受体 I（CD64）、II（CD32）和 III（CD16）的表达情况，方法如前所述。
   1. 简言之，将 THP-1 细胞分别与荧光标记的抗 CD64、抗 CD32 和抗 CD16 抗体（材料表）在室温下避光孵育 30 分钟（用含 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:100 稀释）。
   2. 用含 2% FBS 的 PBS 洗涤三次，通过流式细胞术检测表面染色情况。
      注意：如先前报道，THP-1 细胞 CD16 表达为阴性，CD32 和 CD64 表达为阳性（图 1）。
3. 进行吞噬实验时，于实验前一天接种 THP-1 细胞，起始密度为 2.5 × 10⁵ 个细胞/mL，以确保实验当天细胞密度约为 5 × 10⁵ 个细胞/mL。
   注意：确保实验当天细胞密度在 4–6 × 10⁵ 个细胞/mL 范围内。

3. 吞噬作用检测（图2）

1. 开始实验前，封闭（>1 h）使用 PBS 中含 150 μL 每孔的无菌 2% FBS，将两块圆底 96 孔板（一块用于调理作用，另一块用于吞噬作用）进行处理。
   注意： 将 1 号板标记为调理作用板，用于溴化乙锭（EtBr）染色和调理作用。将 2 号板标记为吞噬作用板，用于 THP-1 细胞铺板和吞噬作用步骤。
2. 寄生虫染色与调理作用
   1. 取1.6中制备的IE悬液，调整细胞浓度至3.3 × 10⁷ 每毫升感染性虫体（IEs）通过添加寄生虫培养基和溴化乙锭（EtBr），使其终浓度达到2.5 μg/mL（从0.1 mg/mL的储备液按1:40稀释）。
      注意： EtBr 可染色寄生虫 DNA，从而通过流式细胞术进行检测。
      警告： EtBr 是一种诱变剂，对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激性。操作时应采取适当的防护措施，并根据当地法规处理废弃物。
   2. 从其中一个96孔板（调理素化板）中移除封闭液，轻弹平板，并在纸巾上除去多余的液体。
   3. 在板的上半部分每孔加入30 μL上述制备的感染红细胞（IE）悬液。留一孔为空白，仅加入30 µL寄生虫培养基（不含IE，作为THP-1单独对照）。图3A室温避光孵育10分钟。
   4. 每孔加入 170 µL 寄生虫培养基。将培养板在 500 × g 条件下离心 x g 室温孵育3分钟，然后将平板在合适的废液容器上方轻弹以去除上清液。
   5. 用寄生虫培养基每孔200 µL将溴化乙锭标记的IEs再洗涤两次，以500 × g离心板子 x g 室温下孵育3分钟。第一次洗涤后的上清液可通过轻弹酶标板去除。使用多通道移液器小心移除第二次洗涤的上清液，确保完全移除洗涤液。切勿扰动沉淀物。
   6. 将溴化乙锭标记的IEs重悬于30 μL用寄生虫培养基配制的、含所需浓度抗体/血浆/血清的溶液中。
   7. 始终包括以下对照组（图3B）：无IEs/THP-1细胞的对照（寄生虫培养基）；无任何抗体或血浆/血清的对照（非调理对照）；使用市售兔抗人红细胞抗体以1:100稀释度作为阳性对照（见 材料表）；两个阴性血浆/血清对照，1:5稀释（一个来自无疟疾暴露史的个体混合样本，另一个来自有疟疾暴露史的男性混合样本）；以及一个阳性血清对照，1:5稀释（来自有疟疾暴露史且既往妊娠过（ preferably multigravidae）的女性混合样本）。
      注意： 阳性对照采用1:100稀释度在不同批次的外购抗体中均表现出稳定的效果（数据未显示）。然而，建议每次使用新批次抗体时，通过测试多个稀释度以排除批次间的差异。
   8. 37 °C 避光孵育 45 分钟。
3. THP-1 细胞制备与吞噬作用
   1. 在进行IEs的调理作用（3.2.8）的同时，开始准备THP-1细胞。
   2. 将 THP-1 细胞从培养瓶中取出，离心沉淀（500 x g 室温孵育5分钟，倾去上清液，将沉淀重悬于THP-1细胞培养基中。
   3. 再次离心（500 x g 室温孵育5分钟后，倾去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL THP-1细胞培养基中。
   4. 确定上述制备溶液中的细胞数量，并加入更多培养基以获得终浓度为 5 x 10⁵ cells/mL
   5. flicking 96-孔板并将其多余液体在纸巾上弃去，从剩余的96-孔板（吞噬作用板）中移除封闭液。
   6. 按 3.3.4 节制备的 THP-1 细胞悬液，每孔加入 100 μL，然后放回细胞培养孵育箱中（图3C).
   7. 抗体/血浆/血清孵育时间结束后，每孔加入 170 µL 寄生虫培养基。将培养板在 500 × g 条件下离心 x g 室温孵育3分钟，然后轻弹平板至合适的废液容器上方以去除上清液。
   8. 用寄生虫培养基每孔200 µL将调理化的红细胞再洗涤两次，每次在500 × g下离心平板 x g 室温下静置3分钟。第一次洗涤后的上清液可通过轻弹酶标板去除。第二次洗涤后，使用多通道移液器小心吸走上清液，确保完全移除所有洗涤液，切勿扰动沉淀。
   9. 最后，将调理化的IE重悬于100 µL预热的THP-1细胞培养基中。取50 µL调理化的IE悬液加入吞噬作用检测板的每个孔中。由于IE总体积为100 µL，每种抗体/血清稀释度可在吞噬作用检测板中设置两个复孔。图3D)
      注意： 检测中使用的IEs与THP-1细胞数量对应于10:1的比例。
   10. 在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下避光孵育40分钟₂).
       注意： 吞噬作用持续时间不得超过40分钟。
   11. 通过在 4 °C 下离心（500）终止吞噬作用 x g，5 分钟），通过轻弹培养板弃去上清液。加入 150 µL 室温的氯化铵裂解液（材料表）并用移液器吹打混匀，准确孵育3分钟。
       注意： 此步骤将裂解未被THP-1细胞吞噬的红细胞。
   12. 通过加入 100 µL 冰冷的含 2% FBS 的 PBS 终止裂解。在 4 °C 下以 500 x g 3 分钟后，将平板在合适的废液容器上方轻弹以去除上清液。
   13. 用预冷的含2% FBS的PBS溶液，每孔200 µL，洗涤三次，4°C下以500 × g离心洗板 x g 孵育3分钟。最后一次洗涤后，用200 µL预冷的含2% FBS的PBS重悬细胞，并立即进行流式细胞术分析。
       注意： 既往研究在流式细胞术前采用2%多聚甲醛固定细胞³¹，但此处展示的结果均在检测完成后立即获取。若将检测板置于4°C保存，延迟流式细胞术数据采集 不是 推荐，因为溴化乙锭（EtBr）的百分比⁺ THP-1 细胞衰变迅速（图4).

4. 流式细胞术数据采集与分析

注意： 任何支持 96 孔板格式并具备适当激光器/滤光片以检测 EtBr 荧光的流式细胞仪均可使用。

1. 采集时，使用未添加滋养体（IEs）的孔，通过线性前向散射（FSC）与线性侧向散射（SSC）图对 THP-1 细胞设门（图 2A），并在该门内采集 10,000 个事件。
2. 通过直方图分析，在 THP-1 细胞门内检测溴化乙锭（EtBr）的荧光强度（FL3-对数）。
3. 设门时，首先在未添加 IEs 的孔中，通过 FSC 与 SSC 密度图对 THP-1 细胞设门（图 5A）；然后在 FL3（EtBr）直方图中设置阳性门，使用未添加 IEs 的 THP-1 细胞及非调理对照样本（图 5B）。
4. 将上述门型复制到同一块板中所有其他待测样本，并计算 EtBr 阳性 THP-1 细胞的百分比（即已吞噬至少一个 IEs 的 THP-1 细胞）。对于每个待测样本，吞噬作用可报告为绝对值（EtBr⁺ THP-1 细胞的百分比），或以阳性对照为最大值计算的相对吞噬率（百分比）。

结果

图 1：THP-1 细胞表面表达的 Fc 受体。（A）Fcγ 受体 III/CD16（红色）。（B）Fcγ 受体 II/CD32（绿色）。（C）Fcγ 受体 I/CD64（橙色）。未标记的细胞以蓝色显示。

图2：...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板，圆底带盖	Corning	3799	可使用任何类似的板，确保其与拟使用的流式细胞仪兼容
AlbuMAX-II	Gibco	11021-037
AlbuMAX-II (5%)	-	-	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037)，0.2 g/L 次黄嘌呤 (Sigma, H9377) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
抗红细胞抗体	Abcam	ab34858	分装后于 -20°C 冻存。每次实验使用一份分装。
DPBS	Sigma	P8622
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10003D
溴化乙锭溶液	Sigma	E1510	用 RPMI1640 (R5886) 配制 0.1 mg/mL 的储存液。避光保存
FC500 流式细胞仪	Beckman Coulter		可使用任何支持 96 孔板格式并具备合适激光器/滤光片以检测 EtBr 荧光的流式细胞仪
胎牛血清 (FBS)	Gibco	10099-141	使用前进行热灭活
FITC 小鼠抗人 CD16	BD Biosciences	555406 或 556618
FITC 小鼠抗人 CD32	BD Biosciences	552883
FITC 小鼠抗人 CD64	BD Biosciences	555527
FlowLogic 软件	Inivai Technologies		可使用任何流式细胞术分析软件，例如 FlowJo 或 Winlist
庆大霉素 (10 mg/mL)	Sigma	G1272
次黄嘌呤	Sigma	H9377
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Sigma	G7513
裂解液	-	-	15 mM NH4Cl，10 mM NaHCO3，1 mM EDTA
MACS CS 柱及配件	Miltenyi Biotec	130-041-305
寄生虫培养基	-	-	2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，50 µg/mL 庆大霉素 (Sigma, G1272)，0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
青霉素/链霉素 (10000 U 和 10 mg/mL)	Sigma	P0781
RPMI-1640 培养基	Sigma	R5886
THP-1 培养基	-	-	10% FBS (Gibco, 10099-141)，2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 链霉素 (Sigma, P0781) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS 磁铁	Miltenyi Biotec