一种定量检测抗体介导的吞噬寄生虫感染红细胞的实验方法

摘要

来源：Quintana, M. d. P. 等，利用基于流式细胞术的检测方法测定自然获得的针对Plasmodium falciparum寄生虫的吞噬诱导抗体。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种基于流式细胞术的吞噬作用检测方法，涉及标记并经调理的颗粒 恶性疟原虫-单核细胞对感染红细胞的吞噬作用。流式细胞术检测到单核细胞内的荧光，证实通过吞噬作用成功识别了已包被的红细胞。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 寄生虫培养

注意：遵循当地关于人类病原体处理的法规。

1. 按照先前所述的标准方案，在寄生虫培养基中（参见材料表）维持Plasmodium falciparum寄生虫的培养。
2. 使用山梨醇处理，使寄生虫保持高度同步化，方法如前所述。
3. 为确保Plasmodium falciparum感染红细胞（IE）表面表达VAR2CSA，使用与蛋白G磁珠偶联的抗VAR2CSA抗体（例如PAM1.4抗体，一种交叉反应性人源单克隆VAR2CSA特异性IgG）进行多轮免疫磁珠分选。
   1. 简言之，将晚期滋养体阶段感染红细胞（trophozoite-IEs）与偶联抗VAR2CSA抗体的磁珠孵育，并利用磁铁进行阳性筛选。
   2. 将筛选后的寄生虫在培养中扩增数个周期，直至寄生率至少达到5%。
   3. 或者，也可按照先前所述方法，选择能够结合固定于塑料表面的CSA（VAR2CSA的受体）的寄生虫。
4. 为验证筛选后寄生虫表面的VAR2CSA表达，按先前所述方法进行流式细胞术分析。
   1. 简言之....

结果

图 1：THP-1 细胞表面表达的 Fc 受体。（A）Fcγ 受体 III/CD16（红色）。（B）Fcγ 受体 II/CD32（绿色）。（C）Fcγ 受体 I/CD64（橙色）。未标记的细胞以蓝色显示。

图2：.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板，圆底带盖	Corning	3799	可使用任何类似的板，确保其与拟使用的流式细胞仪兼容
AlbuMAX-II	Gibco	11021-037
AlbuMAX-II (5%)	-	-	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037)，0.2 g/L 次黄嘌呤 (Sigma, H9377) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
抗红细胞抗体	Abcam	ab34858	分装后于 -20°C 冻存。每次实验使用一份分装。
DPBS	Sigma	P8622
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10003D
溴化乙锭溶液	Sigma	E1510	用 RPMI1640 (R5886) 配制 0.1 mg/mL 的储存液。避光保存
FC500 流式细胞仪	Beckman Coulter		可使用任何支持 96 孔板格式并具备合适激光器/滤光片以检测 EtBr 荧光的流式细胞仪
胎牛血清 (FBS)	Gibco	10099-141	使用前进行热灭活
FITC 小鼠抗人 CD16	BD Biosciences	555406 或 556618
FITC 小鼠抗人 CD32	BD Biosciences	552883
FITC 小鼠抗人 CD64	BD Biosciences	555527
FlowLogic 软件	Inivai Technologies		可使用任何流式细胞术分析软件，例如 FlowJo 或 Winlist
庆大霉素 (10 mg/mL)	Sigma	G1272
次黄嘌呤	Sigma	H9377
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Sigma	G7513
裂解液	-	-	15 mM NH4Cl，10 mM NaHCO3，1 mM EDTA
MACS CS 柱及配件	Miltenyi Biotec	130-041-305
寄生虫培养基	-	-	2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，50 µg/mL 庆大霉素 (Sigma, G1272)，0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
青霉素/链霉素 (10000 U 和 10 mg/mL)	Sigma	P0781
RPMI-1640 培养基	Sigma	R5886
THP-1 培养基	-	-	10% FBS (Gibco, 10099-141)，2 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513)，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 链霉素 (Sigma, P0781) 溶于 RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS 磁铁	Miltenyi Biotec