一种利用荧光报告分子体外检测中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的实验方法

摘要

来源：Frey, D. L., 等 监测人类痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性。 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种体外检测痰液样本中中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的实验方法。含有分泌型蛋白酶的样本与携带识别基序的荧光报告分子共同孵育。当蛋白酶切割该识别基序后，报告分子的供体和受体荧光基团得以分离，各自发出荧光信号，从而指示样本中蛋白酶的活性。

方案

注意：以下方案描述了中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性的样品制备及定量方法。本文所述实验步骤主要针对人痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）或组织蛋白酶G（CG）活性的测定。然而，通过略微调整样品制备流程，也可用于血液来源细胞和肿瘤匀浆的分析。此外，使用特异性的FRET探针，同样可对基质金属蛋白酶以及组织蛋白酶S的活性进行类似检测。

1. 样品制备：细胞分离与上清液分离

注意：如果可能，应在咳痰后120分钟内对痰液进行处理，并在进一步处理前将痰液置于冰上保存。

1. 若无法自然咳出痰液，可按照先前所述方法诱导痰液。简言之，在开始诱导痰液前，先吸入200 µg的β-2受体激动剂沙丁胺醇。随后，使用雾化器吸入高渗（6%）生理盐水溶液15分钟。将咳出的痰液收集于培养皿中。
2. 借助移液器吸头，将黏液团块与唾液分离，并转移至另一培养皿中。
3. 称量黏液。
   注意： 黏液样本的平均重量为0.8 g（范围在0.1 g至5 g之间）；通常0.1 g已足够进行上述操作。
4. 向痰液中加入4倍体积（v/w）的10% Sputolysin溶液（溶于PBS中）（例如，每克痰液加入4 mL 10% Sputolysin）。
   注意： Sputolysin由磷酸盐缓冲液中的高浓度二硫苏糖醇组成，操作时需格外小心。
5. 将混合物置于摇床中，在室温（RT）下孵育15分钟，以溶解黏液。出于安全考虑，应将摇床放置于通风橱内。
6. 加入等体积的冷PBS以终止反应（例如：每1 mL 10% Sputolysin加入1 mL冷PBS）。
7. 通过移液混匀，获得均一溶液。
8. 将混合液经100 µm尼龙细胞滤网过滤至50 mL离心管中。
9. 再经40 µm尼龙细胞滤网重复过滤一次。
10. 在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟。
11. 小心转移上清液至新的离心管中，并置于冰上保存。
    注意： 上清液可于-20 °C或-80 °C保存，直至进一步分析。
12. 用500 µL冷PBS轻柔重悬细胞沉淀，并置于冰上。
    ​注意： 细胞组分必须立即处理。

2. 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性测定

注意： 本文介绍了利用 FRET 报告分子定量 NSP 活性的不同方法。技术的选择取决于具体的生物医学问题和实验目的。所展示的探针已针对一组与肺部相关的酶进行了特异性验证。尽管这些探针对其靶向酶具有特异性，但仍需始终在感兴趣的临床样本上验证探针的特异性。可通过在添加探针前将样本与特异性蛋白酶抑制剂共同孵育来实现验证，该处理应能消除供体/受体（D/A）比值的任何升高。

1. 可溶性NSP活性定量 通过 荧光计或酶标仪检测
   ​注意： 可使用任何具备荧光检测功能的仪器检测样品可溶组分中的蛋白酶活性。
   1. 将酶在冰上解冻。
   2. 使用前，将NE和CG保存在酸性储存缓冲液（50 mM 醋酸钠，200 mM NaCl，pH 5.5）中，以防止自切割。
   3. 为建立酶标准曲线，在活化缓冲液（10 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）中配制酶的1:2系列稀释液（NE为33.9 - 0.271 nM；CG为42.6 - 0.333 nM）。该活化缓冲液为中性pH，可有效促进酶催化反应的进行。
      1. 为制备最高标准浓度（NE浓度：33.9 nM），取1 µL NE（33.9 µM）加入999 µL活化缓冲液中稀释。
      2. 为制备第二个标准品（NE 浓度：16.95 nM），将 200 µL 第一次稀释液与 200 µL 激活缓冲液混合。
      3. 按照相同步骤制备其余的1:2稀释液。
      4. 最后一个标准品为不含样品的空白对照，由纯活化缓冲液组成。建议对标准品和样品进行技术重复测定，至少做双复孔或三复孔。在标准品和样品制备过程中，应将小瓶置于冰上保存。
   4. 与标准制备过程同时进行，将痰液样本用激活缓冲液稀释。在检测蛋白酶活性前，需对人源样本进行稀释，以确保报告信号（D/A比值）的增加处于线性范围内。若患者样本未经稀释，底物裂解将过快，导致无法进行可靠的数据拟合。由于健康供体痰液中的活性蛋白酶含量低于囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的样本，因此通常需采用不同的稀释倍数（健康痰液上清液为1:10，COPD或CF患者痰液上清液为1:20–500）。
      注意： 为了定量测定酶浓度未知样本中的蛋白酶活性，需要平行测定已知酶浓度的标准曲线，最好在同一块酶标板上进行。人痰液中活性酶的浓度据此计算得出 通过 通过将人体痰液样本中测得的斜率与标准曲线中测得的斜率进行插值。
   5. 在准备测量样品前，先设置仪器。将基于NE福斯特共振能量转移（FRET）探针（NEmo-1）的激发波长设为354 nm，检测波长设为供体400 nm、受体490 nm。将CG FRET探针（sSAM）的激发波长设为405 nm，发射波长设为485 nm（供体）和580 nm（受体）。
   6. 向黑色96孔半面积板的各孔中加入40 µL样品、标准品或空白溶液。
   7. 配制含有报告分子的主混合液（主混合液中报告分子的浓度为 10 µM）：将探针原液（1 mM，溶于二甲基亚砜 DMSO 中）用活化缓冲液按 1:100 比例稀释。根据所需孔数乘以 10 µL 计算并配制相应体积的主混合液。为达到中性粒细胞弹性蛋白酶 NEmo-1 和 sSAM 报告分子荧光检测的最佳终浓度（2 µM），向每孔（含 40 µL 样品、标准品或空白溶液）加入 10 µL 主混合液，并立即开始检测读数。因此，NEmo-1 和 sSAM 报告分子将分别用于监测可溶性中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶 G 的活性。
      注意： 如果无法使用试剂注射器，务必在将报告试剂加入样品后尽快开始读数。
   8. 启动酶标仪检测，每60-90秒记录一次D/A比值的增加，持续至少20分钟，或直至信号增长达到平台期。
   9. 数据导出后，通过将每个时间点和样本的供体相对荧光单位（RFU）除以受体RFU来计算D/A比值。
   10. 计算每个样本的D/A比值的平均值和标准差。
   11. 确定D/A比值变化线性增长阶段的斜率。该斜率是FRET探针酶切速率的指标。通过将人源样本所得的线性回归斜率与酶标准品计算得到的斜率进行拟合，计算痰液中活性酶的浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 µm 尼龙细胞滤网	Corning Inc.	431752
2300 EnSpire（多标记微孔板读板仪）	PerkinElmer
35x10 mm 培养皿，Nunclon Delta	Thermo Fisher Scientific	150318
40 µm 尼龙细胞滤网	Corning Inc.	431750
50 mL 离心管	Sarstedt	10535253
天平	OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	PR124
BD Falcon 圆底离心管，5 mL	BD Bioscience	352054
BD LSRFortessa 细胞分析仪	BD Bioscience
黑色平底 96 孔半面积板	Corning Life Science	3694
组织蛋白酶 G	Elastin Products Company	SG623
组织蛋白酶 G 抑制剂 I	Merck KGaA	219372
Centrifuge 5418R 离心机	Eppendorf AG	EP5401000137
Combitips advanced 1.0 mL 吸头	Eppendorf AG	0030 089 430
完全蛋白酶抑制剂	Roche	11697498001
人痰液白细胞弹性蛋白酶	Elastin Products Company	SE563
Multipette plus 移液器	Eppendorf AG
NEmo-1	SiChem	SC-0200	1 mM
NEmo-2E	SiChem	SC-0201	2 mM
Pari Boy SX 配 LC Sprint 喷射式雾化器	Pari	085G3001
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010-015
ROTI Histokitt（封片介质）	Carl Roth GmbH + Co.KG	6638.1
沙丁胺醇	Teva GmbH
西维列司他	Cayman Chemicals	17779
Sputolysin	Calbiochem	560000-1SET
sSAM	in house		2 mM