一种使用全血进行快速中性粒细胞趋化性分析的基于微流控芯片的方法

摘要

来源:Yang， K. et al.一种直接从一滴血中快速分析中性粒细胞趋化性的全芯片方法。J. Vis. Exp.（124）、（2017 年）

该视频演示了使用全芯片方法的中性粒细胞趋化性测定。该方法允许通过免疫磁阴性选择从全血中直接分离中性粒细胞，然后在微流体芯片上进行趋化性测定。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 微流体装置制备。

1. 微流控细胞迁移检测制备
   1. 在生物安全柜内将 50 μL 纤连蛋白储备液 （1 mg/mL） 稀释到 950 μL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中，制备 50 μg/mL 纤连蛋白溶液。
   2. 通过将 9 mL 罗斯威尔公园纪念研究所培养基 （RPMI-1640） 和 1 mL RPMI-1640 与 4% 牛血清白蛋白 （BSA） 混合来制备迁移培养基。
   3. 从设备中取出去离子水。
   4. 从出口向装置中加入 100 μL 纤连蛋白溶液。等待 3 分钟以确保所有通道都充满纤连蛋白溶液。将微流体装置在室温下置于有盖的培养皿中 1 小时。
   5. 从设备中取出纤连蛋白溶液。从出口处添加 100 μL 迁移培养基。等待 3 分钟，以确保所有通道都填充了迁移介质。
   6. 在室温下将设备再孵育 1 小时;然后设备已准备好进行趋化性实验。
2. 用于趋化性实验的趋化剂溶液制备。​
   1. 在总共 1 mL 迁移培养基中制备 100 nM fMLP 溶液。在 1.5 mL 试管中混合 5 μL FITC-葡聚糖储备液（10 kDa，1 mM）与 fMLP 溶液><。 注意:FITC-Dextran 用于梯度测量。或者，使用罗丹明作为梯度指示剂。然后，fMLP 趋化剂溶液即可用于趋化性实验。
3. 痰液样本制备。
   注意: 由 COPD 患者痰液样本梯度诱导的中性粒细胞趋化性被测试为这种全芯片方法的临床诊断应用。
   1. 获取人类伦理协议以收集 COPD 患者的痰液样本。
      注意:我们获得了在温尼伯七橡树综合医院采集样本的批准（经曼尼托巴大学批准）。
   2. 从所有受试者那里获得知情的书面同意书。
   3. 收集 COPD 患者的自发痰样本。将 500 μL 痰液样品放入 1.5 mL 试管中。
   4. 在 1.5 mL 试管中加入 500 μL 0.1% 二硫苏糖醇，并轻轻混合。将试管置于 37 °C 的水浴中 15 分钟。
   5. 将样品以 753 x g 离心 10 分钟，然后收集上清液。将上清液以 865 x g 离心 5 分钟，然后收集最终上清液。使用前将收集的上清液储存在 -80 °C 冰箱中。
   6. 准备好进行趋化性实验后，解冻痰液;将 900 μL 迁移培养基转移到 1.5 mL 试管中，并在生物安全柜内与 100 μL 痰液混合;然后痰液溶液即可用于趋化性实验。
4. 血样采集。
   1. 获得人类伦理协议，从健康捐献者那里采集血液样本。向所有献血者索取知情的书面同意书。
      注意: 样本是在温尼伯的维多利亚总医院获得的（由曼尼托巴大学联合学院研究伦理委员会批准）。
   2. 通过静脉穿刺收集血样，并将样本放入 EDTA 涂层管中。实验前将试管保存在生物安全柜中。

2. 全芯片趋化性分析作

1. 片上细胞分离（图 1B）。
2. 将 10 μL 全血放入生物安全柜内的 1.5 mL 试管中。
   注意: 血液样本采集的详细信息见第 1.4 节。
3. 将 2 μL 抗体混合物 （Ab） 和 2 μL 中性粒细胞分离试剂盒中的 MP（参见材料表）添加到 1.5 mL 试管中，轻轻混匀;这将标记血液中除中性粒细胞外的细胞。
4. 将 blood-Ab-MP 混合物在室温下孵育 5 分钟><。 注意: 这将磁性标记血液中抗体标记的细胞。
5. 将两个小磁盘连接到设备的单元加载端口的两侧。从设备的所有端口吸出介质。
6. 从细胞加载端口缓慢将 2 μL 血液-Ab-MP 混合物移液到微流控装置中><。 注:磁性标记的细胞被困在细胞加载端口的侧壁上，而嗜中性粒细胞将流入装置并被困在细胞对接结构处。
7. 等待几分钟，直到足够的嗜中性粒细胞被困在细胞对接区域。

3. 趋化性测定（图 1C）。

1. 将微流体装置放在 37 °C 的温控显微镜载物台上。
2. 使用两个移液器将 100 μL 趋化剂溶液（fMLP 或痰液）和 100 μL 迁移培养基添加到其指定的入口储液器中;这将通过在压力平衡结构的辅助下通过基于层流的连续化学混合在梯度通道中产生趋化剂梯度><。 注意:COPD 患者痰液采集的详细信息见第 1.3 节。
   1. 对于培养基对照实验，只需将迁移培养基添加到两个入口储液槽中。
3. 在梯度通道中获取 FITC-Dextran 的荧光图像。
4. 使用命令"File|打开"。
5. 使用命令"Analyze|绘图配置文件"。
6. 将测量数据导出到电子表格中，以便进一步绘图。
7. 将设备在温控显微镜载物台或常规细胞培养箱中孵育 15 分钟。
8. 使用 10X 物镜对梯度通道进行成像，以记录细胞的最终位置以进行数据分析。
9. 如果需要，通过延时显微镜记录设备中的细胞迁移。

4. 细胞迁移数据分析（图 1C）

1. 通过计算细胞从对接结构的迁移距离来分析趋化性测定，如下所述。参见图 1C。
2. 将图像导入 NIH ImageJ 软件（版本 1.45）。
3. 选择移动到渐变通道中的每个单元格的中心。
4. 测量所选单元格的最终位置的坐标。测量停靠结构边缘处的点的坐标作为初始参考位置。
5. 将测量的坐标数据导出到电子表格软件（例如 Excel）。将单元的迁移距离计算为单元的最终位置与沿梯度方向的初始参考位置之间的差值。
6. 校准千分尺的距离。计算所有细胞迁移距离的平均值和偏差作为趋化性的量度。
7. 使用 Student t 检验将存在趋化剂梯度的迁移距离与中等对照实验进行比较。
8. 如果记录了细胞迁移的延时图像，则可以通过细胞示踪分析进一步分析细胞迁移和趋化性><。 注意:材料表中详细介绍了构建和执行全芯片趋化性测定所需的材料。

结果

图 1:用于中性粒细胞趋化性分析的全芯片方法图示。（A） 微流体装置的图示。该设备包括两层。第一层（4 μm 高）定义了细胞对接屏障通道，以将细胞捕获在梯度通道旁边。第二层（60 μm 高）定义了梯度产生通道、样品池加载的端口和通道、化学入口储液槽和废液出口。对齐标记是为这两个图层设计的。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为 60 mm 和 200 μm;下游蛇形输入通道的长度和宽度分别为 6 mm 和 280 μm;（B） 全芯片细胞分离方法的图示;（C） 趋化性试验图示。

材料