一种基于微流控芯片的全血快速中性粒细胞趋化分析方法

摘要

来源：Yang, K., 等. 一种直接从一滴血快速进行中性粒细胞趋化分析的全芯片方法。J. Vis. Exp. (124), (2017)

本视频展示了使用全芯片法进行中性粒细胞趋化实验。该方法通过免疫磁珠负向筛选直接从全血中分离中性粒细胞，随后在微流控芯片上进行趋化实验。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 微流控装置的制备。

1. 微流控细胞迁移实验准备
   1. 在生物安全柜内，将50 µL储存浓度为1 mg/mL的纤连蛋白原液用950 µL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，配制成50 µg/mL的纤连蛋白溶液。
   2. 将9 mL RPMI-1640培养基与1 mL含4%牛血清白蛋白（BSA）的RPMI-1640培养基混合，制备迁移培养基。
   3. 从芯片装置中移除去离子水。
   4. 从出口端向装置中加入100 µL纤连蛋白溶液，等待3分钟以确保所有通道均被溶液充满。将微流控装置置于加盖的培养皿中，在室温下孵育1小时。
   5. 从装置中移除纤连蛋白溶液，从出口端加入100 µL迁移培养基，等待3分钟以确保所有通道均被迁移培养基充满。
   6. 再于室温下孵育1小时，装置即可用于趋化实验。
2. 趋化实验中趋化因子溶液的配制。​
   1. 在总共1 mL迁移培养基中配制100 nM fMLP溶液。在1.5 mL离心管中，将5 µL储存浓度为1 mM的FITC-葡聚糖（10 kDa）与fMLP溶液混合。
      注意：FITC-葡聚糖用于浓度梯度的测定。也可选用罗丹明作为梯度指示剂。fMLP趋化因子溶液即可用于趋化实验。
3. 痰液样本的制备。
   注意：本研究将慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液样本所形成的浓度梯度诱导的中性粒细胞趋化作用，作为该全芯片方法的临床诊断应用进行测试。
   1. 获取人类伦理审批，用于收集COPD患者的痰液样本。
      注意：我们在温尼伯的Seven Oaks综合医院获得了样本采集的批准（由曼尼托巴大学审批通过）。
   2. 从所有受试者处获取书面知情同意书。
   3. 收集COPD患者自发咳出的痰液样本。将500 µL痰液样本置于1.5 mL离心管中。
   4. 向1.5 mL离心管中加入500 µL 0.1%二硫苏糖醇（DTT），轻轻混匀。将离心管置于37 °C水浴中孵育15分钟。
   5. 在753 × g条件下离心10分钟，收集上清液；再于865 × g条件下离心5分钟，收集最终上清液。将所得上清液储存于-80 °C冰箱中，待用。
   6. 进行趋化实验前，将痰液溶液解冻；在生物安全柜内，将900 µL迁移培养基转移至1.5 mL离心管中，并与100 µL痰液溶液混合；痰液溶液即可用于趋化实验。
4. 血液样本采集。
   1. 获取人类伦理审批，用于从健康供体采集血液样本。从所有献血者处获取书面知情同意书。
      注意：本研究中样本采集于温尼伯的维多利亚综合医院（由曼尼托巴大学联合学院研究伦理委员会批准）。
   2. 通过静脉穿刺采集血液样本，并将样本注入EDTA抗凝管中。实验前将样本管置于生物安全柜内保存。

2. 全芯片化学趋化性检测操作

1. 芯片上细胞分离（图1B）。
2. 在生物安全柜内，将10 µL全血置于1.5 mL离心管中。
   注意：血液样本采集的详细步骤见第1.4节。
3. 从嗜中性粒细胞分离试剂盒（参见材料表）中取2 µL抗体混合物（Ab）和2 µL磁性颗粒（MP），加入1.5 mL离心管中，轻轻混匀；此步骤将标记血液中除嗜中性粒细胞外的其他细胞。
4. 将血液-Ab-MP混合物在室温下孵育5分钟。
   注意：此步骤将使血液中被抗体标记的细胞带上磁性标签。
5. 将两个小型磁铁圆盘分别固定在装置的细胞加样口两侧。从装置的所有端口吸出液体。
6. 从细胞加样口缓慢吸取2 µL血液-Ab-MP混合物，注入微流控装置中。
   注意：被磁性标记的细胞将被捕获在细胞加样口的侧壁上，而嗜中性粒细胞则流入装置内部，并在细胞对接结构处被捕获。
7. 等待数分钟，直至有足够数量的嗜中性粒细胞被捕获在细胞对接区域。

3. 趋化性实验（图1C）。

1. 将微流控装置放置在温度可控的显微镜载物台上，调节温度至 37 °C。
2. 使用两个移液器，分别向指定的入口储液池中加入 100 µL 趋化因子溶液（fMLP 或痰液溶液）和 100 µL 迁移培养基；通过基于连续层流的化学混合，并借助压力平衡结构，可在梯度通道内形成趋化因子浓度梯度。
   注意： 慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰液采集的详细步骤见第 1.3 节。
   1. 在培养基对照实验中，仅向两个入口储液池中均加入迁移培养基。
3. 获取梯度通道中 FITC-葡聚糖的荧光图像。
4. 使用“文件｜打开”命令将图像导入 ImageJ 软件。
5. 使用“分析｜轮廓分析”命令测量梯度通道横截面上的荧光强度分布。
6. 将测量数据导出至电子表格，用于进一步绘图分析。
7. 将装置置于温度可控的显微镜载物台或常规细胞培养孵育箱中孵育 15 分钟。
8. 使用 10X 物镜对梯度通道进行成像，记录细胞的最终位置，用于数据分析。
9. 如需要，可通过延时显微成像记录装置内细胞的迁移过程。

4. 细胞迁移数据分析（图1C）

1. 按照下述方法，通过计算细胞从对接结构迁移的距离来分析趋化性实验。参见图1C。
2. 将图像导入NIH ImageJ软件（版本1.45）。
3. 选择迁移至浓度梯度通道中的每个细胞的中心位置。
4. 测量所选细胞最终位置的坐标，并测量对接结构边缘某一点的坐标，作为初始参考位置。
5. 将测得的坐标数据导出至电子表格软件（例如 Excel）。沿浓度梯度方向，计算每个细胞最终位置与初始参考位置之间的差值，即为细胞迁移距离。
6. 将距离校准为微米单位。计算所有细胞迁移距离的平均值和偏差，作为趋化性的量化指标。
7. 使用Student's t-检验，比较存在趋化因子梯度条件下的迁移距离与培养基对照实验的迁移距离。
8. 若已记录细胞迁移的时间序列图像，则可进一步通过细胞轨迹追踪分析对细胞迁移和趋化性进行分析。
   注意： 构建和实施芯片上全集成趋化性实验所需的材料详见材料表。

结果

图1：中性粒细胞趋化性分析全芯片方法示意图。（A）微流控装置示意图。该装置包含两层。第一层（高4 µm）定义了细胞停靠屏障通道，用于将细胞捕获在梯度通道旁。第二层（高60 µm）定义了梯度生成通道、细胞加载的端口和通道、化学试剂入口储液池以及废液出口。两层均设计有对齐标记。对于第二层，上游蛇形输入通道的长度和宽度分别为60 mm和200 µm；下游蛇形输入通道的长度和宽度分别为6 mm和280 µm；（B）全芯片细胞分离方法示意图；（C）趋化性实验示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
器件制备
掩模对准器	ABM	N/A
匀胶机	Solitec	5000
加热板	VWR	11301-022
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-001
真空干燥器	Fisher Scientific	08-594-15A
SU-8 2000 稀释剂	Microchem	SU-8 2000
SU-8 2025 光刻胶	Microchem	SU-8 2025
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷	Gelest	78560-45-9
硅晶圆	Silicon, Inc	LG2065
载玻片	Fisher Scientific	12-544-4
切割垫	N/A	N/A	定制
打孔器
芯片上细胞分离与趋化实验
RPMI 1640 培养基	Fisher Scientific	SH3025502
DPBS	Fisher Scientific	SH3002802
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	SH3057402
纤连蛋白	VWR	CACB356008
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
磁性圆盘	Indigo Instruments	44202-1	直径 5 mm，厚度 1 mm
FITC-葡聚糖	Sigma-Aldrich	FD10S
罗丹明	Sigma-Aldrich	R4127-5G
吉姆萨染色液	Rowley Biochemical Inc	G-472-1-8OZ
EasySep 直接人中性粒细胞分离试剂盒	STEMCELL Technologies Inc	19666
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D0632
尼康 Ti-U 倒置荧光显微镜	Nikon	Ti-U
显微镜环境培养室	InVivo Scientific	N/A
CCD 相机	Nikon	DS-Fi1