一种用于研究预先活化的CD8+ T细胞对癌细胞毒性的体外实验方法

摘要

来源：Kitamura, T.，等。利用CD8⁺ T细胞实时检测体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了由预先激活的效应T细胞诱导癌细胞的凋亡检测实验。通过将这些细胞与带有荧光标记细胞核的癌细胞共培养，并加入可被caspase切割的荧光底物。发生凋亡的癌细胞其细胞核将呈现不同的荧光颜色，从而产生双荧光信号。该双荧光信号表明癌细胞正在经历凋亡过程。

方案

1. 准备在其细胞核中表达红色荧光蛋白的靶细胞

1. 从合适的来源获取目标小鼠癌细胞系。
   注意：本实验方案中使用的是E0771小鼠乳腺肿瘤细胞的高转移性衍生细胞系（E0771-LG）。亲本E0771细胞来源于C57BL/6小鼠。
2. 在37 °C、95%湿度和5% CO₂的细胞培养孵育箱中，使用含10% (v/v) 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）复苏并维持E0771-LG细胞冻存管。
   注意：应确认细胞无支原体污染。为此，按照上述方法（不添加抗生素和抗真菌剂）将E0771细胞（或待检测细胞）培养2-3天，收集500 μL培养基。以12,419 × g 离心60秒以去除细胞碎片，将上清液转移至新管中。使用市售的支原体检测试剂盒（参见材料表）和/或按照制造商说明进行PCR检测来确定是否存在支原体污染。
3. 将每孔5 × 10³个E0771-LG细胞接种至12孔板中，在37 °C、95%湿度和5% CO₂的孵育箱中，用含10% (v/v) FBS的DMEM培养基过夜培养。
   注意：若目标细胞增殖速率较低（群体倍增时间大于36小时），可将接种细胞数量增加至1 × 10⁴个。
4. 更换培养基为1 mL含10 μg/mL多聚素（polybrene）的10% (v/v) FBS-DMEM，并加入25 μL编码核定位红色荧光蛋白（mKate2，参见材料表）的慢病毒颗粒（1 × 10⁶ TU/mL）。
5. 在37 °C、95%湿度和5% CO₂的孵育箱中继续培养细胞24小时。
6. 更换为不含polybrene的10% (v/v) FBS-DMEM，继续在37 °C、95%湿度和5% CO₂的孵育箱中培养24–48小时。
7. 当细胞开始表达红色荧光蛋白时，更换培养基为含1 μg/mL嘌呤霉素的10% (v/v) FBS-DMEM，并继续培养至细胞融合度达到80–90%。
   注意：不同目标细胞类型所需的嘌呤霉素浓度可能不同，应使用未转染的细胞进行浓度优化。
8. 将存活下来的细胞在含1 μg/mL嘌呤霉素的10% (v/v) FBS-DMEM中传代培养1–3代，并在液氮气相储存系统中冻存备用。

2. 从小鼠肿瘤中分离抑制性细胞

注意： 在此方案中，抑制性细胞（即， 从由E0771-LG细胞建立的含转移性肿瘤的肺组织中分离出转移相关巨噬细胞（MAMs）和单核细胞-髓系来源的抑制性细胞（M-MDSCs）。应优化组织解离和细胞分选条件，以从不同组织中分离这些细胞。

1. 将1 × 10⁶个癌细胞（E0771-LG）注射至同源（C57BL/6）雌性、7至10周龄小鼠的尾静脉中。
2. 14天后，分离含有转移性肿瘤的肺组织，并通过酶消化法将灌注后的肺组织制备成单细胞悬液，方法如前所述。
   注意：本方案中，共向四只小鼠注射癌细胞，并将其转移性肺组织合并，以获得足够数量的抑制性细胞。
3. 将单细胞悬液与抗小鼠CD16/CD32抗体在冰上孵育30分钟，再加入CD45、F4/80、CD11b、Ly6C和Ly6G的荧光标记抗体（参见材料表），继续孵育30分钟。
4. 用含2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液1 mL洗涤染色细胞一次，然后将细胞沉淀重悬于500–1000 μL含2%（w/v）BSA的PBS溶液中。
5. 加入3 μM的DAPI，使用流式细胞分选仪分选M-MDSCs（DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^highLy6C^high）和MAMs（DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^highLy6C^low）（图1）。
   注意：区分MAMs（Ly6C低表达）与M-MDSCs（Ly6C高表达）的Ly6C表达水平阈值，依据的是肺泡静息巨噬细胞（RMAC）的表达水平。分选后细胞纯度通过流式细胞术检测，预期纯度超过90%。
6. 将分选后的细胞重悬于400 μL含20%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%（v/v）青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1%（v/v）非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和50 nM 2-巯基乙醇的DMEM培养基中（称为富集型DMEM，E-DMEM）。
7. 采用台盼蓝排斥法计数活细胞数量，并用E-DMEM调整细胞浓度至2 × 10⁶个细胞/mL。
8. 将细胞置于冰上保存，待用。

3. 从小鼠脾脏中分离CD8⁺ T细胞

1. 从与目标癌细胞系同源的小鼠中分离脾脏（即， 本方案中使用的 C57BL/6 小鼠操作如下：
   1. 通过 CO 处死动物₂ 吸入
   2. 将动物置于干净的解剖板上，用70% (v/v) 乙醇擦拭皮肤。
   3. 使用剪刀剪开腹部皮肤以暴露脾脏
   4. 分离位于胃下方的脾脏，并将其放入含有5 mL预冷PBS的离心管中。
2. 使用无菌5 mL注射器的内芯活塞，将脾脏在置于50 mL离心管上的100 μm细胞筛网上研磨。
3. 用总共10 mL的PBS将细胞通过滤器。
4. 将细胞悬液以 337 x g 5 分钟后，吸除上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于1 mL含有2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%（w/v）BSA的PBS（运行缓冲液）中，并通过40 μm细胞滤网过滤。
6. 计数活细胞数量并调整至 1 x 10⁸ cells/mL，使用运行缓冲液。
   注意： 保留少量细胞作为富集前样品，用于纯度检测。
7. 富集 CD8⁺ 使用阴性选择试剂盒和磁力分选仪分离T细胞（参见 材料表).
   1. 转移 1 × 10⁸ 将1 mL脾细胞悬液转移至5 mL聚苯乙烯圆底管中。
   2. 加入50 μL生物素化抗体，室温孵育10分钟。
   3. 加入125 μL链霉亲和素偶联磁珠，室温孵育5 min。
   4. 加入1.325 mL洗脱缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀。
   5. 将试管放入磁力架中，室温孵育2.5分钟。
   6. 拿起磁铁，将富集的细胞悬液倒入新管中。
8. 用200 μL E-DMEM重悬富集的细胞（即., 含20% (v/v) FBS、1% (v/v) 青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1% (v/v) 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠和50 nM 2-巯基乙醇的DMEM培养基。
9. 计数活细胞数量，并调整至 2 x 10⁶ 细胞/mL，用E-DMEM重悬。将细胞置于37 °C、含CO₂的培养箱中培养。₂ 孵育器中保存至使用。
   注意： 保留少量细胞作为富集后的样本，用于纯度检测。
10. 确定CD8的纯度⁺ 通过流式细胞术检测T细胞，步骤如下：
    1. 取 1 × 10⁴ 来自预富集（步骤3.6）或富集后（步骤3.9）样品的细胞，用运行缓冲液将每个样品的总体积调整至100 μL。
    2. 将单细胞悬液与抗小鼠 CD16/CD32 抗体在冰上孵育 30 分钟，然后用针对 CD45、CD3、CD4 和 CD8 的荧光标记抗体进行染色（参见 材料表再继续孵育30分钟。
    3. 用含2%（w/v）BSA的500 μL PBS洗涤染色后的细胞，并用500–1000 μL含2%（w/v）BSA的PBS重悬细胞沉淀。
11. 加入 3 μM 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），并测定 CD3 阳性细胞的百分比⁺CD4^–CD8⁺ 总CD45中的细胞⁺ 细胞群体

4. 分离的CD8⁺ T细胞的活化与扩增

1. 分装 1 x 10⁵ 每50 μL CD8的细胞数⁺ 将T细胞（步骤3.9中制备）加入至U型底96孔板的孔中。
2. 加入 1 × 10⁵ 每50 μL抑制细胞（按步骤2.7制备）或50 μL E-DMEM加入至各孔中。
3. 制备激活培养基，其成分为 E-DMEM、4 × 10⁴ U/mL 集落刺激因子1（CSF-1）、240 U/mL 白细胞介素-2（IL-2）、8 μg/mL 抗小鼠 CD3ε 抗体和 16 μg/mL 抗小鼠 CD28 抗体。
   注意： CSF-1 对 T 细胞活化并非必需，但在本方案中对抑制性细胞（即 MAMs 和 M-MDSCs）的存活至关重要。因此，在 T 细胞与靶向癌细胞共培养时保留 CSF-1，以维持培养条件的一致性。由于 CSF-1 在所有组织中均以纳摩尔浓度存在，且对单核细胞/巨噬细胞的存活具有必要性 体内 这是这些细胞的生理环境。
4. 加入50 μL活化培养基（步骤4.3）和50 μL含或不含待测试剂的E-DMEM。
5. 将培养板置于37 °C、95%湿度、5% CO₂的培养箱中_2, 培养细胞4天。

5. 靶细胞与预先激活的CD8⁺ T细胞共培养体系的建立

1. 加入30 μL按1:100稀释的生长因子减少型可溶性基底膜基质（材料表) 加入适合显微镜观察的平底96孔板的孔中，并在37 °C的CO₂培养箱中孵育。₂ 孵育至少1小时。
2. 制备靶细胞（即表达细胞核限制性红色荧光蛋白的 E0771-LG 细胞）。
   1. 将靶细胞与1 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA在室温下孵育1分钟，然后通过轻柔吹打收集细胞。
   2. 加入含有10%（v/v）FBS的DMEM培养基9 mL，并将细胞悬液在337 x g条件下离心 g 5 分钟。
   3. 用500 μL E-DMEM重悬细胞，并计数活细胞数量。
      注意： 在计数目标细胞前，通过40μm细胞滤网过滤细胞，以获得单细胞悬液。
   4. 调整密度至 2 x 10⁴ 细胞/毫升（= 1 × 10³ 每50 μL用E-DMEM调整细胞数量，并将细胞置于冰上。
3. 制备效应细胞（即，预先活化的CD8⁺ T细胞
   1. 在96孔板的一个孔中（步骤4.5），通过移液充分重悬细胞，并转移悬浮的CD8⁺ 将T细胞转移至新的1.5 mL离心管中。
      注意： MAMs 和 M-MDSCs 紧密贴附于培养孔壁，无法通过移液操作使其脱离。
   2. 为收集剩余细胞，向孔中加入 200 μL PBS，并转移至 5.3.1 步骤中的试管中。
   3. 用1 mL E-DMEM洗涤细胞一次（337 x g）5分钟，吸除并弃去上清液），用100 μL E-DMEM重悬细胞。
   4. 使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量，将细胞密度调整至1.6 × 10⁵ 个细胞/毫升（= 4 × 10³ 细胞/25 μL），并将细胞置于冰上。
4. 吸出第5.1步中每个孔板孔中的基底膜基质。
5. 加入 1 x 10³ 将细胞/每孔50 μL靶细胞（步骤5.2.4）加入各孔，并充分混匀。
   注意： 为避免因培养基蒸发导致的边缘效应，分析时应仅使用96孔板的内圈60个孔。
6. 加入25 μL含4 x 10⁶个细胞的E-DMEM培养基³ U/mL IL-2 和 10 μM 荧光 caspase-3 底物（参见 材料表).
7. 加入 4 x 10³ 细胞/25 μL CD8⁺ 将T细胞（步骤5.3.4）加入适当的孔中，并充分混匀。
   注意： 孔中细胞过多会增加分析难度。在此模型中，效应细胞与靶细胞的比例为4:1（总细胞数为5 × 10³ 细胞/孔）为最佳比例，而8:1的比例则次之。为便于数据分析，需设置以下四种对照组孔：与共培养孔相同密度的靶细胞（1 × 10³ 细胞/孔）接种于含或不含caspase-3底物的培养基中，效应细胞（1 × 10³ 细胞/孔）接种于含或不含caspase-3底物的培养基中。
8. 向所有空孔（尤其是板边缘的孔）中加入 200 μL PBS 或无菌水，以减少实验孔中培养基的蒸发。
9. 将培养板放入维持在37 °C、95%湿度和5% CO₂的活细胞成像荧光显微镜中₂.
   注意： 以十字形方式振荡培养板，使所有细胞均匀分布，随后将培养板置于室温下的平坦表面上静置10–20分钟，再转移至培养箱中。

6. 细胞成像

注意：详细的图像采集设置将根据所使用的显微镜和荧光染料而有所不同；应采用以下通用采集参数以获得最佳结果。

1. 在显微镜上使用适当的自动对焦程序，获取96孔板中每个实验孔至少占总表面积25%的图像。
2. 设置显微镜以采集相差图像，以及适用于核限制性红色荧光蛋白（mKate2）的荧光通道和适用于绿色荧光激活型caspase-3底物（激发波长488 nm）的荧光通道的图像（图2）。
3. 每隔1至3小时，在实验孔中采集相差图像及两个荧光通道的图像，持续至少72小时。

结果

图 1. 从转移性肺组织中分离抑制性细胞的设门策略。（A）用于分离单核细胞型髓源性抑制细胞（M-MDSCs）和转移相关巨噬细胞（MAMs）的代表性点图。区分 MAMs（Ly6C^low）与 M-MDSCs（Ly6C^high）的 Ly6C 表达水平阈值，参照肺泡常驻巨噬细胞（RMAC）的表达水平设定。（B）分选后 M-MDSCs（CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^high）和 MAMs（CD45⁺Ly6G^-...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12孔细胞培养板	Freiner Bio-One	665-180
1× PBS	Gibco	14190-094
2-巯基乙醇	Sigma	M6250-10ML
5 mL 聚苯乙烯圆底管	FALCON	352054
96孔细胞培养板（圆底）	Costar	3799	CD8+T细胞与分选髓系细胞的共培养
96孔板（平底）	Nunc	165305	CD8+T细胞与靶细胞共培养用于细胞毒性检测
AF647 标记的抗小鼠 F4/80 抗体	BIO-RAD	MCA497A647	克隆：CIA3-1，批号：1707，2 μ升/每百万细胞
AlexaFluor700 抗小鼠 CD8 抗体	Biolegend	100730	克隆：53-6.7，批号：B205738，0.5 μL/1×10⁶ 个细胞
抗小鼠 CD28 抗体	Biolegend	102111	分离的 CD8+ T 细胞活化，克隆号：37.51，批号：B256340
抗小鼠 CD3e 抗体	Biolegend	100314	分离的 CD8+ T 细胞活化，克隆号：145-2C11，批号：B233720
APC抗小鼠CD3抗体	Biolegend	100236	克隆：17A2，批号：B198730，0.5 μ升/每百万细胞
APC/Cy7 标记的抗小鼠 Ly6C 抗体	Biolegend	128026	克隆：HK1.4，批号：B248351，1 μ升/每10^6个细胞
牛血清白蛋白	Sigma	A1470-100G
细胞筛（100μm 尼龙	FALCON	352360	脾脏的破碎处理
细胞滤网（40μm 尼龙	FALCON	352340	过滤肺组织消化液
DAPI	Biolegend	422801
杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 培养基	Gibco	41966-029
EasySep 小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	19853
胎牛血清	Gibco	10270-106
FITC 标记的抗小鼠 CD4 抗体	Biolegend	100406	克隆：GK1.5，批号：B179194，0.5 μL/1×10⁶ 个细胞
Geltrex 即用型	Gibco	A1596-01	用于细胞毒性检测的96孔板包被
IncuCyte NucLight Red 慢病毒试剂	Essen BioScience	4476	编码 mKate2 的慢病毒颗粒
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		检测器（荧光显微镜）
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		分析软件
L-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	Gibco	A2916801
肺组织解离试剂盒	Miltenyi	130-095-927	从荷瘤肺组织制备单细胞悬液
MycoAlert 支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-318
非必需氨基酸（100X）	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	荧光生成型caspase-3底物
PE 抗小鼠 Ly6G 抗体	Biolegend	127607	克隆：1A8，批号：B258704，0.5 μL/1×10⁶ 个细胞
PE/Cy7 抗小鼠 CD11b 抗体	Biolegend	101216	克隆：M1/70，批号：B249268，0.5 μL/1×10⁶ 个细胞
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	用于细胞原代培养的青霉素-链霉素
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD45 抗体	Biolegend	103132	克隆：30-F11，批号：B249564，0.5 μL/1×10⁶ 个细胞
聚凝胺（Hexadimethrine bromide）	Sigma	H9268
嘌呤霉素	Gibco	A11138-03
RBC裂解缓冲液（10X）	Biolegend	420301
重组小鼠 IL-2	Peprotech	212-12	分离的CD8+ T细胞的激活
丙酮酸钠（100X）	Gibco	11360-070
TruStain fcX（抗小鼠 CD16/32）抗体	Biolegend	101320