巨噬细胞中多种Caspase激活的评估

摘要

来源：Han, J. 等，利用Caspase激活评估先天免疫细胞死亡。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了通过流感病毒感染刺激骨髓来源的巨噬细胞，以评估多种caspase的激活情况。在巨噬细胞裂解、裂解物热灭活及离心后，收集细胞内caspase用于后续免疫学分析。

方案

1. 溶液的配制

1. 制备L929条件培养基。
   1. 将1 × 10⁶个L929细胞（参见材料表）接种于含有50 mL L929培养基的182 cm²组织培养瓶中（培养基的配制方法见表1）。
   2. 将细胞置于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的湿润培养箱中培养。
   3. 7天后，收集上清液，并用0.45 µm滤器过滤。分装成50 mL等分试样（冻存的样品可在−80 °C保存最多1年）。
2. 配制500 mL骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基（表1）。
3. 配制500 mL BMDM刺激培养基（表1）。
4. 配制500 mL用于感染的培养基（表1）。
5. 配制100 mL 1 M Tris缓冲液（表1）。
6. 配制4倍浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（表1）。
7. 配制1 mL 1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT，表1）。
8. 配制40 mL caspase裂解缓冲液（表1）。
9. 配制100 mL 1.5 M Tris缓冲液（表1）。
10. 配制100 mL 10%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（表1）。
11. 配制50 mL 2倍浓度的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（表1）。
12. 配制5 mg/mL脂多糖（LPS）溶液（表1）。
13. 配制0.5 M三磷酸腺苷（ATP）溶液（表1）。
14. 配制蛋白质印迹（western blotting）相关溶液。
    1. 配制1 L 5倍浓度电泳缓冲液储备液（表1）。
    2. 配制1 L 10倍浓度转膜缓冲液储备液（表1）。
    3. 配制1 L含Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST，表1）。
    4. 配制100 mL 5%（wt/vol）脱脂奶粉封闭液（表1）。
15. 配制一抗溶液。
    1. 配制10 mL caspase-1一抗溶液（表1）。
    2. 配制10 mL caspase-11一抗溶液（表1）。
    3. 配制10 mL caspase-3一抗溶液（表1）。
    4. 配制10 mL caspase-7一抗溶液（表1）。
    5. 配制10 mL caspase-8一抗溶液（表1）。
    6. 配制10 mL caspase-9一抗溶液（表1）。
    7. 配制10 mL HRP标记的β-actin一抗溶液（表1）。
16. 配制二抗溶液。
    1. 配制10 mL抗兔二抗溶液（表1）。
    2. 配制10 mL抗鼠二抗溶液（表1）。
    3. 配制10 mL抗大鼠二抗溶液（表1）。

2. 分离骨髓来源的巨噬细胞

注意：本实验方案可使用6至10周龄的野生型小鼠，其程序性细胞死亡（PCD）通路完整；也可使用PCD相关调控因子、效应分子或目标分子被敲除或修饰的突变型小鼠。

1. 将小鼠置于 CO₂ 安乐死舱中，以每分钟置换 10%–30% 笼体积的气流速率持续 2–3 分钟。随后采用二次安乐死方法（如颈椎脱位）。在适用情况下，须遵守所有相关设施、机构及政府的具体指南和法规。
2. 解剖小鼠以获取后肢骨骼。
   1. 将小鼠仰面固定，暴露腹部。用 70%（体积比）乙醇喷洒后肢和腹部进行消毒。
      注意：乙醇易燃，请远离明火。
   2. 使用剪刀在腹部正中线做切口，并继续向腿部方向剪开，使股骨暴露。
   3. 抓住右侧后肢，将皮肤从身体向中线方向剥离。沿中线切断内收肌群，将腿部与身体分离；然后在髋关节与脊柱之间切断腿部。接着在踝关节远端切断足部，并通过撕去皮肤及使用略微张开的剪刀剥离小腿组织，去除骨骼上的多余组织。
   4. 将腿部置于浸有 70%（体积比）乙醇的毛巾上，分离胫骨和股骨。
      1. 分别用镊子夹住胫骨和股骨。轻轻将胫骨沿膝关节自然方向按压，使其在膝部断裂。
      2. 如有需要，使用镊子和解剖剪去除残留的悬垂组织。将胫骨保存备用，放置于乙醇浸湿的毛巾上。
      3. 以同样方式折断膝部，收集股骨。
   5. 对左侧后肢重复上述第 3 和第 4 步，将其从身体上分离并解剖出胫骨和股骨。
   6. 用 70%（体积比）乙醇喷洒骨骼。
   7. 将骨骼置于洁净的 70%（体积比）乙醇浸湿毛巾上，用手挤压骨骼的肉质部分，并用毛巾摩擦骨骼表面，以清除多余组织。
3. 待两侧股骨和胫骨均清洁后，用 70%（体积比）乙醇喷洒全部四根骨骼。将骨骼收集至无菌培养皿中，加入 10 mL BMDM 培养基，轻轻晃动培养皿进行冲洗。
4. 用 10 mL 新鲜 BMDM 培养基填充一支 10 mL 注射器，并安装一根 25 G 针头。
5. 用镊子夹取胫骨，然后以约 45° 角切断踝关节。
6. 冲洗胫骨中的骨髓。
   1. 将胫骨持于 50 mL 离心管上方，使其较窄的一端朝下。从已装满培养基的注射器中将培养基滴加至胫骨上。
   2. 将针头（初始动作要轻柔）插入骨髓腔顶端，注入培养基。
   3. 拔出针头后再次插入。通过短促、高压的推注方式注入培养基，并将针头逐步深入骨髓腔内。
   4. 当培养基开始从骨骼底部流出时，继续以短促、高压的方式推注，持续冲洗细胞。在此过程中观察骨骼颜色，当骨骼变为白色时，弃去该骨。
   5. 对两根胫骨均进行上述操作。
7. 对股骨重复上述第 5 和第 6 步操作，在髋关节处切断（如同在踝关节处切断胫骨）。使用同一个 50 mL 离心管收集冲洗出的骨髓及 BMDM 培养基。
8. 完成四根骨骼的冲洗后，用装有 18 G 针头的 10 mL 注射器将 50 mL 离心管中的骨髓与培养基反复抽吸 3 次，每次抽吸时冲洗管壁，以充分分散骨髓组织。
9. 用 BMDM 培养基将 50 mL 离心管中的终体积调整至 30 mL，并确保细胞充分悬浮。
10. 使用 70 µm 细胞滤网过滤 50 mL 离心管中的 BMDM 培养基。
11. 将所得的细胞悬液（含骨髓前体细胞）接种至三个 150 mm 组织培养皿中，每皿加入 10 mL（约 20 × 10⁶ 个细胞）。随后每皿再添加 10 mL BMDM 培养基。置于 37 °C 恒温湿润培养箱中孵育。

3. BMDM 的分化及实验用细胞的铺板

1. 将接种的骨髓前体细胞在37 °C孵育3天。然后取出每皿，加入额外的5–8 mL BMDM培养基（表1)。放回37 °C培养箱中继续培养。
2. 在初次铺板后的第5天，取出每皿细胞，加入5 mL BMDM培养基，放回37 °C培养箱中继续培养。
3. 第6天，取出每皿细胞，弃去培养基。随后加入10 mL冷的（4 °C保存）磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，弃去10 mL冷PBS洗液。然后每皿加入10 mL新鲜冷PBS，将各培养皿置于冰上孵育5 min。
4. 使用细胞刮棒，轻轻将三个培养皿中的细胞刮下并收集至一个 50 mL 离心管中。在 270 × g 4 °C 下离心 5 分钟；然后弃去上清液。
5. 加入20 mL BMDM培养基，用移液器吹打重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。
   注意： 预计每只小鼠可获得约 60 × 10⁶-100 × 10⁶ 细胞
6. 规划好12孔板中所需的布局 体外 细胞死亡/炎症刺激实验。计划接种 1 × 10⁶ 每孔细胞数。针对每种计划的刺激条件，至少设置三个生物学重复，并接种两组孔板：一组用于收获至caspase裂解缓冲液，另一组用于收获至RIPA缓冲液。
7. 接种 1 × 10⁶ 将细胞以每孔1 mL BMDM培养基接种于12孔板中。在37 °C、湿润培养箱中培养过夜，随后进行细胞死亡/炎症评估。过夜培养后，吸除培养基，每孔加入1 mL预热至37 °C的PBS洗涤细胞。
8. 移除 PBS 洗涤液，加入 500 µL 含抗生素的 BMDM 刺激培养基（如进行非细菌性刺激）或不含抗生素的 BMDM 刺激培养基（如进行细菌性刺激）表1）。在进入步骤4之前，孵育2小时 体外 刺激/感染

4. 刺激或感染细胞

注意：本方案中涉及的试剂可能具有致病性，须在获得相关机构和政府主管部门批准的生物安全二级（BSL2）设施中，采取适当的预防措施进行操作。

1. 用感兴趣的刺激物激活BMDM以诱导细胞死亡。
   注意： 本方案以流感病毒A（IAV）、单纯疱疹病毒1型（HSV1）、Francisella novicida 和LPS + ATP为例进行说明，但也可使用其他刺激物。
   1. 示例刺激1：用IAV（A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]）感染细胞（按Hoffmann等人的方法构建；通过MDCK细胞中的噬斑实验测定病毒滴度以计算感染复数[MOI]）：
      1. 使用公式（1）和公式（2）计算在感染复数（MOI）为20 PFU时所需的病毒体积：
         
         
         
   2. 移除BMDM中的培养基，用500 µL PBS洗涤细胞一次。向每孔加入450 µL不含热灭活胎牛血清（HI-FBS）的高糖DMEM培养基配制的IAV（20 MOI）。将培养板置于37 °C湿润培养箱中孵育1小时，以允许病毒吸附。
   3. 取出培养板，向每孔加入50 µL HI-FBS。将培养板放回37 °C培养箱，继续孵育至总时长为12小时。

5. 收集用于caspase蛋白印迹的合并上清液和蛋白裂解物

1. 孵育4小时、12小时或16小时后（具体时间取决于所使用的诱导剂），从培养箱中取出培养板。
2. 移除150 µL上清液；弃去或保存用于其他上清液分析（例如酶联免疫吸附测定[ELISA]）。不要移除剩余的上清液。
3. 通过将每孔50 µL半胱天冬酶裂解缓冲液与100 µL 4x SDS缓冲液混合，制备蛋白收集液（表1）。然后向每孔加入150 µL该混合液。
4. 对于每孔，用移液器反复吹打混合液，以收集裂解的细胞和上清液。吹打的同时，用移液器吸头刮擦孔底，以充分破坏细胞。刮擦和吹打后，将蛋白裂解液收集至已标记的1.5 mL离心管中。
5. 使用加热金属块将所有离心管在100 °C加热12分钟。
6. 在室温下以14,500 × g 离心30秒，使不溶性组分沉淀。
   ​注意： 此处可暂停——合并后的上清液与蛋白裂解液可立即使用，或在−20 °C保存最多2个月，或在−80 °C保存最多6个月，待使用时取出。

类别	试剂	准备	备注	安全注意事项
培养基	L929 细胞培养基	1) 热灭活胎牛血清（FBS）（参见备注）。 2) 将43.5 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、5 mL 热灭活胎牛血清（HI-FBS）、0.5 mL 丙酮酸钠、0.5 mL 非必需氨基酸和0.5 mL 青霉素-链霉素混合。	56 °C孵育30分钟以热灭活胎牛血清。
	骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基	将 290 mL IMDM、150 mL L929 条件培养基、5 mL 非必需氨基酸、50 mL 灭活胎牛血清（HI-FBS）和 5 mL 青霉素-链霉素混合。	使用前将培养基在37 °C水浴或珠浴中预热。培养基可在4 °C保存最多1周。
	含抗生素的BMDM刺激培养基	将445 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、50 mL的热灭活胎牛血清（HI-FBS）和5 mL的青霉素-链霉素混合。	使用前将培养基在37 °C水浴或珠浴中预热。培养基可在4 °C保存最多1周。
	不含抗生素的BMDM刺激培养基	将450 mL DMEM与50 mL HI-FBS混合。	使用前将培养基在水浴或珠浴中预热至37 °C。培养基可在4 °C保存最多1周。
	感染用培养基（不含热灭活胎牛血清）	将495 mL高糖DMEM与5 mL青霉素-链霉素溶液混合。	将培养基在使用前于水浴或珠浴中预热至37 °C。培养基可在4 °C保存最多1周。
十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液	1 M Tris缓冲液 （用于4倍SDS缓冲液）	1) 将12.11 g Tris溶解于80 mL去离子水中。 2) 边搅拌边滴加 HCl，调节 pH 至 6.8。 3) 加入去离子水，定容至 100 mL。	缓冲液可在 4 °C 下保存长达 1 个月。	盐酸具有腐蚀性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。盐酸应在通风橱中操作。
	4x SDS 缓冲液	1) 将60 mL 1 M Tris（pH 6.8）溶液、24 mg SDS、100 mg 溴酚蓝、120 mL 甘油、8.4 mL β-巯基乙醇（BME）和90 mL 去离子水混合。 2) 在加热磁力搅拌器上搅拌，使盐类充分溶解。 3) 加入去离子水定容至终体积300 mL。	缓冲液可分装后于−20 °C保存，最长可达1年。	SDS具有腐蚀性，BME具有致癌性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。SDS和BME应在通风橱中操作。
Caspase 裂解缓冲液	1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）	将0.154 g DTT粉末溶解于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。使DTT充分溶解。	缓冲液可分装为每份200 μL，于−20 °C保存，最长可保存1年。
	Caspase 裂解缓冲液	将35 mL去离子水、4 mL NP-40、750 μL 1 M DTT、1片蛋白酶抑制剂和1片磷酸酶抑制剂混合。	缓冲液可在 4 °C 下保存长达 1 个月。
放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液	1.5 M Tris 缓冲液 （用于RIPA缓冲液）	1) 将18.2 g Tris溶解于80 mL去离子水中。 2) 边搅拌边滴加 NaOH，将 pH 调至 8.8。 3) 加入去离子水，定容至 100 mL。	缓冲液可在 4 °C 下保存长达 1 个月。	NaOH 具有腐蚀性，可导致灼伤。务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。
	10% (wt/vol) SDS 溶液 （用于 RIPA 缓冲液）	1) 将10 g SDS加入80 mL去离子水中。 2) 搅拌至溶解。 3) 加入去离子水，定容至 100 mL。	该溶液可在室温下保存长达6个月。若溶液出现沉淀，可轻轻加热以重新溶解。	SDS具有腐蚀性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。SDS应在通风橱中操作。
	RIPA缓冲液 (2倍浓度储存液)	1) 将0.5 g脱氧胆酸钠、1 mL NP-40、0.876 g NaCl、3.3 mL 1.5 M Tris（pH 8.8）、1 mL 10%（wt/vol）SDS加入46 mL去离子水中，混匀。 2) 搅拌至溶解。 3) 加入去离子水，定容至 50 mL。	2× RIPA 储存液可在 4 °C 保存长达 1 个月。	SDS 具有腐蚀性。操作时必须穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。SDS 应在通风橱中操作。
无菌触发器	LPS	溶解冻干的LPS 大肠杆菌 0111:B4 溶于无内毒素水中，配制成 5 mg/mL 的浓度。	该溶液可在 −20 °C 保存长达 2 年。
	0.5 M ATP	将1 g冻干ATP溶解于3.63 mL无内毒素水中。	溶液可分装后于 −20 °C 保存，最长可保存 2 年。
Western blotting 溶液	运行缓冲液 (5倍浓缩液)	1) 将15 g Tris碱、72 g甘氨酸和5 g SDS溶于900 mL去离子水中。 2) 搅拌至无任何颗粒残留。 3) 加入去离子水，定容至 1 L。	缓冲液可在室温下保存长达6个月。	SDS具有腐蚀性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。SDS应在通风橱中操作。
	转移缓冲液 (10倍浓缩储备液)	1) 将30.3 g Tris碱和72 g甘氨酸溶于900 mL去离子水中。 2) 搅拌至无任何颗粒残留。 3) 加入去离子水，定容至 1 L。	缓冲液可在室温下保存长达3个月。
	含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBST）	1) 将2.42 g Tris碱和8.76 g NaCl溶解于850 mL去离子水中。 2) 边搅拌边滴加 HCl，将 pH 值调节至 7.4。 3) 加入去离子水，定容至 1 L。 4) 加入0.5 mL吐温20（终浓度为0.05%（体积/体积））。	溶液可在室温下保存1个月。	盐酸具有腐蚀性。操作时务必穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。盐酸应在通风橱中操作。
	5%（wt/vol）脱脂奶粉封闭液	将5 g脱脂奶粉溶解于100 mL TBST中。	该溶液可在 4 °C 下保存长达 1 周。
一抗	Caspase-1 一抗	将抗caspase-1抗体按1:1,000（体积比）稀释，即在10 mL含5%（质量/体积）脱脂奶粉的封闭液中加入10 μL抗体。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 制备。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不会降低效力。若需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	Caspase-11 一抗	将10 μL抗caspase-11抗体加入10 mL 5%（wt/vol）脱脂奶粉封闭液中，按1:1,000（vol/vol）比例稀释抗体。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 配制。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不影响效果。如需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	Caspase-3 一抗	将抗caspase-3抗体和抗cleaved caspase-3抗体分别按1:1,000（体积比）稀释，即各取10 μL抗体加入同一份10 mL的5%（质量/体积）脱脂奶粉封闭液中。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 制备。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不影响效果。若需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	Caspase-7 一抗	将抗caspase-7抗体和抗cleaved caspase-7抗体分别按1:1,000（体积比）稀释，即各取10 μL抗体加入同一份10 mL的5%（质量体积比）脱脂奶粉封闭液中。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 配制。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不影响效果。若需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	Caspase-8 一抗	将抗caspase-8抗体和抗cleaved caspase-8抗体分别取10 μL加入同一份10 mL的5%（wt/vol）脱脂牛奶封闭液中，稀释至1:1,000（vol/vol）。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 配制。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不会降低效力。若需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	Caspase-9 一抗	将抗caspase-9抗体按1:1,000（体积/体积）稀释，即在10 mL含5%（重量/体积）脱脂奶粉的封闭液中加入10 μL抗体。	为获得最佳效果，建议每次实验 freshly 制备。然而，该溶液至少可重复使用 3 次而不影响效果。若需重复使用，请于 −20 °C 保存。
	HRP偶联的β-actin一抗	将2 μL抗β-actin抗体加入10 mL 5%（wt/vol）脱脂奶粉封闭液中，按1:5,000（vol/vol）比例稀释抗体。	该抗体应每次实验前新鲜配制。
二抗	抗兔抗体	将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗按1:5,000（体积比）稀释，即取2 μL抗体加入10 mL 5%（重量/体积）脱脂牛奶封闭液中。	每次均应新鲜配制抗体稀释液。
	抗小鼠抗体	将 HRP 标记的二抗按 1:5,000（体积比）稀释，取 2 μL 抗体加入 10 mL 5%（质量/体积）脱脂奶粉封闭液中。	每次均应新鲜配制抗体稀释液。
	抗大鼠抗体	将 HRP 标记的二抗按 1:5,000（体积比）稀释，即取 2 μL 抗体加入 10 mL 5%（重量/体积）脱脂奶粉封闭液中。	每次均应新鲜配制抗体稀释液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 μm 滤膜	Millipore	SCHVU05RE
10 mL 注射器	BD Biosciences	309604
12 孔板	Corning	07-200-82
18 G 针头	BD Biosciences	305195
25 G 针头	BD Biosciences	305122
50 mL 离心管	Fisher Scientific	50-809-218
70 μm 细胞筛	Corning	431751
150 mm 组织培养皿	Corning	430597
182 cm² 组织培养瓶	Genesee Scientific	25-211
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL 胰蛋白酶大豆肉汤	BD Biosciences	211768
珠浴器	Chemglass Life Sciences	CLS-4598-009
Biophotometer D30	Eppendorf	6133000010
细胞刮刀	CellTreat Scientific Products	229315
CO₂ 培养箱	VetEquip	901703
比色皿	Fisher Scientific	14-955-129
解剖剪刀	Thermo Fisher Scientific	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995-073
乙醇	Pharmco	111000200
胎牛血清	Biowest	S1620
滤纸	Bio-Rad	1703965
镊子	Fisher Scientific	22-327379
Francisella novicida (U112 菌株)	BEI Resources	NR-13
庆大霉素	Gibco	15750060
恒温金属浴	Fisher Scientific	23-043-160
单纯疱疹病毒 1 型 (HF 菌株)	ATCC	VR-260
高糖 DMEM	Sigma	D6171
加湿培养箱	Thermo Fisher Scientific	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientific	12440-053
甲型流感病毒 (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	按 Hoffmann 等人方法构建
L929 细胞	ATCC	CCL-1	用于制备 L929 条件培养基的细胞系
L-半胱氨酸	Thermo Fisher Scientific	BP376-100
MDCK 细胞	ATCC	CCL-34	用于测定甲型流感病毒滴度的细胞系
微量离心机	Thermo Fisher Scientific	75002401
非必需氨基酸	Gibco	11140050
NP-40 溶液	Sigma	492016
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
青霉素和链霉素	Sigma	P4333
培养皿	Fisher Scientific	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
电源	Bio-Rad	164-5052
蛋白酶抑制剂片	Sigma	S8820
氢氧化钠	Sigma	72068
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
方形培养皿	Fisher Scientific	FB0875711A
台式离心机	Thermo Fisher Scientific	75004524
大肠杆菌 O111:B4 超纯脂多糖 (LPS)	InvivoGen	tlrl-3pelps
Vero 细胞	ATCC	CCL-81	用于测定 HSV1 病毒滴度的细胞系