巨噬细胞中多种Caspase激活的评估

摘要

来源：Han, J. 等，利用Caspase激活评估先天免疫细胞死亡。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了通过流感病毒感染刺激骨髓来源的巨噬细胞，以评估多种caspase的激活情况。在巨噬细胞裂解、裂解物热灭活及离心后，收集细胞内caspase用于后续免疫学分析。

方案

1. 溶液的配制

1. 制备L929条件培养基。
   1. 将1 × 10⁶个L929细胞（参见材料表）接种于含有50 mL L929培养基的182 cm²组织培养瓶中（培养基的配制方法见表1）。
   2. 将细胞置于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的湿润培养箱中培养。
   3. 7天后，收集上清液，并用0.45 µm滤器过滤。分装成50 mL等分试样（冻存的样品可在−80 °C保存最多1年）。
2. 配制500 mL骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基（表1）。
3. 配制500 mL BMDM刺激培养基（表1）。
4. 配制500 mL用于感染的培养基（表1）。
5. 配制100 mL 1 M Tris缓冲液（表1）。
6. 配制4倍浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（表1）。
7. 配制1 mL 1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT，表1）。
8. 配制40 mL caspase裂....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 μm 滤膜	Millipore	SCHVU05RE
10 mL 注射器	BD Biosciences	309604
12 孔板	Corning	07-200-82
18 G 针头	BD Biosciences	305195
25 G 针头	BD Biosciences	305122
50 mL 离心管	Fisher Scientific	50-809-218
70 μm 细胞筛	Corning	431751
150 mm 组织培养皿	Corning	430597
182 cm² 组织培养瓶	Genesee Scientific	25-211
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL 胰蛋白酶大豆肉汤	BD Biosciences	211768
珠浴器	Chemglass Life Sciences	CLS-4598-009
Biophotometer D30	Eppendorf	6133000010
细胞刮刀	CellTreat Scientific Products	229315
CO₂ 培养箱	VetEquip	901703
比色皿	Fisher Scientific	14-955-129
解剖剪刀	Thermo Fisher Scientific	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995-073
乙醇	Pharmco	111000200
胎牛血清	Biowest	S1620
滤纸	Bio-Rad	1703965
镊子	Fisher Scientific	22-327379
Francisella novicida (U112 菌株)	BEI Resources	NR-13
庆大霉素	Gibco	15750060
恒温金属浴	Fisher Scientific	23-043-160
单纯疱疹病毒 1 型 (HF 菌株)	ATCC	VR-260
高糖 DMEM	Sigma	D6171
加湿培养箱	Thermo Fisher Scientific	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientific	12440-053
甲型流感病毒 (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	按 Hoffmann 等人方法构建
L929 细胞	ATCC	CCL-1	用于制备 L929 条件培养基的细胞系
L-半胱氨酸	Thermo Fisher Scientific	BP376-100
MDCK 细胞	ATCC	CCL-34	用于测定甲型流感病毒滴度的细胞系
微量离心机	Thermo Fisher Scientific	75002401
非必需氨基酸	Gibco	11140050
NP-40 溶液	Sigma	492016
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
青霉素和链霉素	Sigma	P4333
培养皿	Fisher Scientific	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
电源	Bio-Rad	164-5052
蛋白酶抑制剂片	Sigma	S8820
氢氧化钠	Sigma	72068
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
方形培养皿	Fisher Scientific	FB0875711A
台式离心机	Thermo Fisher Scientific	75004524
大肠杆菌 O111:B4 超纯脂多糖 (LPS)	InvivoGen	tlrl-3pelps
Vero 细胞	ATCC	CCL-81	用于测定 HSV1 病毒滴度的细胞系