一种基于多重微球的检测方法用于分析人泪液样本中的细胞因子

摘要

来源：Balne, P. K., 等. 基于微球的多重检测法分析泪液细胞因子谱. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种基于微球的多重检测方法，用于分析人泪液中的细胞因子。该方法能够对单一样本中的多种细胞因子进行同时检测，显著提高了灵敏度，有助于研究各种病理生理条件下免疫反应的变化。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 泪液细胞因子分析

1. 泪液采集：
   1. 让受试者舒适地坐在检查椅上，并将头部靠在头托上。
   2. 让受试者向上看，小心打开Schirmer试纸条（由Whatman 41号滤纸制成），将试纸条的圆端置于眼睑下穹窿处，指导受试者闭眼5分钟。在采集泪液时，应尽量减少对眼表的接触。
   3. 让受试者睁开眼睛，取出试纸条并放入无菌的1.5 mL微量离心管中。立即将离心管转移至实验室，或在检测细胞因子谱型前于-80 ^oC保存。
2. 从泪液滤纸条中洗脱泪液样本：
   1. 将泪液滤纸条剪成0.5 cm长度（以标准化待测泪液量），并放入无菌的1.5 mL微量离心管中。
   2. 加入30 µL检测缓冲液，在室温下孵育5分钟，随后以14,000 × g离心1分钟。
   3. 将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中，弃去滤纸条。将含样本的离心管置于冰上，并立即用于细胞因子谱型分析。
3. 试剂准备：
   ​注意：每个样本通过基于微球的多重检测法检测的41种分析物包括：白细胞介素（IL）-1α、IL-1β、IL-Rα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12 p40、IL-12 p70、IL-13、IL-15、IL-17A、干扰素-α（IFN-α）2、IFN-γ、IFN-γ诱导蛋白10（IP-10, CXCL10）、巨噬细胞来源趋化因子（MDC）、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α和MIP-1β、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、MCP-3、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、TNF-β、生长相关癌基因（GRO）、肿瘤生长因子α（TGF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）-2、血小板源性生长因子（PDGF）-AA、PDGF-AB/BB、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）、分形趋化因子（fractalkine）、可溶性CD40配体（sCD40L）、Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）以及活化后调节、正常T细胞表达和分泌蛋白（RANTES）。
   1. 将抗体微球溶液（50X）小瓶恢复至室温（20–25 ^oC），并涡旋震荡1分钟。
   2. 计算实验所需孔数，并据此计算所需总抗体微球混合液（每孔25 µL）及各抗体微球溶液（50X）的用量。
   3. 通过加入计算量的每种抗体微球溶液，并用微球稀释液补足至所需终体积，配制混合液。确保混合液中每种抗体的终浓度为1X。为防止移液误差，应始终多配制至少20%的额外体积。
      注意：例如，对于96孔板实验，需配制3000 µL抗体微球混合液。每种抗体微球溶液所需体积 = 3000 / 各抗体微球溶液的储存浓度；3000 / 50 = 每种抗体微球溶液60 µL
      1. 将41种抗体微球溶液各取60 µL（60 × 41 = 2460 µL）加入混合瓶中，再向抗体微球混合液中加入540 µL微球稀释液，最终配制成3000 µL工作液（1X）。
      2. 使用前充分混匀微球混合液。实验后，将剩余混合液于2–8 ^oC保存，可使用长达30天。
   4. 向QC1和QC2储备液中各加入250 µL去离子水，以配制质控品（QC）。
   5. 通过反复倒置数次并涡旋震荡10秒，充分混匀。将溶液转移至正确标记的聚丙烯微量离心管中，剩余溶液于-20 ^oC保存，可使用长达30天。
   6. 将30 mL 10X洗涤缓冲液与270 mL去离子水混合，充分混匀，配制洗涤缓冲液（稀释前将10X缓冲液恢复至室温，并通过混匀使所有盐类沉淀完全溶解）。未使用的洗涤缓冲液（1X）于2–8 ^oC保存，可使用长达30天。
   7. 向标准品小瓶中加入250 µL去离子水，配制人细胞因子标准品储备液（所有分析物浓度为10,000 pg/mL）。通过反复倒置数次并涡旋震荡10秒，充分混匀。静置10分钟后，将储备液转移至正确标记的聚丙烯微量离心管中。实验后，将剩余溶液于-20 ^oC保存，可使用长达30天。
   8. 使用检测缓冲液对人细胞因子工作标准品进行5倍系列稀释（50 µL -> 200 µL），获得2000、400、80、16和3.2 pg/mL的标准浓度。
   9. 标准品配制完成后，工作标准品应在60分钟内使用，并以检测缓冲液作为空白/背景（-pg/mL）。
4. 基于微球的多重检测法进行细胞因子谱型分析：
   1. 所有试剂在加入96孔微孔板前恢复至室温，并涡旋震荡5–10秒。若洗脱后的泪液样本在检测前于-80 ^oC保存，需在冰上解冻泪液提取物，并以1000 × g离心5分钟。
   2. 按垂直排列方式准备实验工作表，包括人细胞因子工作标准品[0（空白）、3.2、16、80、400、2,000和10,000 pg/mL]、QC1、QC2及样本。
   3. 向每孔加入200 µL 1X洗涤缓冲液，用封板膜密封，于室温（20–25 ^oC）在板式振荡器上孵育10分钟。
   4. 将板倒置，轻拍数次于吸水纸上，以倾倒并去除各孔中残留的洗涤缓冲液。
   5. 向相应孔中分别加入25 µL各工作人细胞因子标准品、QC1、QC2、空白（检测缓冲液）及样本。
   6. 向每孔加入25 µL检测缓冲液。
   7. 向每孔加入25 µL 1X抗体微球混合液。由于抗体微球溶液对光敏感，需用封板膜密封板，并用铝箔包裹，以避免实验过程中暴露于光线下。
   8. 将板置于振荡器上，于4 ^oC孵育过夜。
   9. 将板置于自动磁力板式洗涤仪的板架上。静置1分钟，使磁珠沉降至孔底，然后吸除孔内液体。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，静置1分钟后吸除孔内液体。重复洗涤一次（板的洗涤操作请遵循试剂盒制造商的说明）。
   10. 向每孔加入25 µL检测抗体溶液，密封板，用铝箔包裹，并在振荡器上于室温孵育60分钟。
   11. 向每孔加入25 µL链霉亲和素-藻红蛋白（Streptavidin-Phycoerythrin）溶液，密封板，用铝箔包裹，并在振荡器上于室温孵育30分钟。
   12. 将板置于磁力板式洗涤仪上。静置1分钟后吸除孔内液体。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，静置1分钟后吸除孔内液体。重复洗涤一次。
   13. 向每孔加入150 µL鞘液，并将板置于振荡器上于室温振荡5分钟，以重悬抗体微球。
   14. 立即使用基于微球的多重检测法读板仪读取数据，并采用五参数曲线拟合算法分析细胞因子浓度。泪液细胞因子谱型分析的示意图见图1。
5. 读取检测板（仪器设置）与数据分析：
   1. 开启基于微球的多重检测法读板仪，并预热激光30分钟。
   2. 启动基于微球的多重检测法软件。在“自动维护”选项卡下，选择“校准-验证”选项。将校准和验证微球的每种试剂小瓶涡旋震荡30秒。将每种试剂各5滴加入指定孔中。向指定储液槽中加入去离子水和70%乙醇。

结果

图1：泪液细胞因子谱分析的示意图流程图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Milliplex MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠面板-1 试剂盒	默克，美国	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D Luminex 仪器	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀
xPonent 软件	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀
RBXGenerator 软件	伯乐，法国
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD，法国
平板振荡器	美国康宁公司
TECAN 微孔板洗板机	Tecan，瑞士	HydroSpeed
移液器	Mettler Toledo，加利福尼亚州，美国
1.5 ml 微量离心管	Axygen，美国	MCT-150-C
Schirmer 泪液分泌试验试纸条	眼部护理与治疗，美国	101657
Flexmap 3D 校准试剂盒	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀	40-028
Flexmap 3D 验证试剂盒	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀	40-029
眼科检查椅