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1. 在盖玻片上培养的Vero细胞中进行SARS-CoV-2 RNA-FISH
第1天
- 固定和通透细胞
- 用3.7%（w/v）PFA溶液在室温下固定感染的细胞1小时。
- 吸除3.7% PFA溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
- 在室温下加入PBST溶液，振荡处理10分钟以通透细胞。
- 吸除PBST溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
- 检测
- 吸除1× PBS溶液，用2× SSC在室温下洗涤细胞两次。
- 吸除2× SSC溶液，加入至少300 µL探针杂交缓冲液进行预杂交。盖上含有细胞的孔板，于37 °C孵育30分钟。
- 通过将1.2 pmol探针混合物加入探针杂交缓冲液中，制备探针溶液。
- 使用1.2 µL的1 µM探针储备液制备300 µL工作液。
- 移除预杂交液，将盖玻片转移至湿化 chamber 中。
- 将30–50 µL探针溶液滴加到Parafilm上，形成独立液滴。
- 在37 °C下孵育样品过夜（12–18小时）。
第2天
- 将盖玻片重新转移至12孔板中，在37 °C条件下用400 µL探针洗涤缓冲液洗涤4次，每次5分钟，以去除多余的探针溶液。
注意：作为替代方案，无需将30–50 µL探针溶液分装至Parafilm上并在盖玻片下孵育，可直接向12孔板中的盖玻片加入300 µL探针溶液。此方法更简便，但需要消耗大量试剂。使用前将探针洗涤缓冲液预热至37 °C。计算所需缓冲液体积，并将其转移至15 mL锥形离心管中。
- 在室温下用5x SSCT溶液洗涤样品2次，每次5分钟。
- 用1x PBS溶液替换5x SSCT溶液，并将样品在4 °C保存至扩增步骤。
3. 扩增
- 从孔中移除1x PBS溶液，每孔加入至少300 µL扩增缓冲液。在室温下孵育样品30分钟。
- 分别在不同离心管中对每种HCR发夹结构（h1和h2）进行瞬时降温处理以进行准备。
- 配制300 µL扩增溶液时，每种发夹结构使用18 pmol（例如，对于300 µL体系，使用6 µL浓度为3 µM的储备发夹溶液）。
- 将发夹溶液转移至离心管中。
- 在95 °C孵育90秒。
- 避光条件下冷却至室温，持续30分钟。
- 将瞬时降温后的“h1”和“h2”发夹结构加入扩增缓冲液中，配制成发夹混合液。
- 将30–50 µL发夹混合液滴加到Parafilm膜上。
- 在室温、避光条件下孵育样品过夜（12–18小时）。
第3天
- 将盖玻片放回12孔板中，加入5×SSCT缓冲液，在室温下振荡洗涤5次，每次5分钟，以去除多余的发夹探针。
- 吸除5×SSCT缓冲液，更换为1×PBS。
注意：如有需要，可将RNA-FISH样本用于标准的免疫荧光实验，随后进行细胞核染色（见第1.4节）。
4. 细胞核染色与载玻片封片
- 吸去 1× PBS 溶液，加入含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.2 µg/mL）的 1× PBS 溶液。
- 将样品在室温避光条件下孵育 10 分钟。
- 吸去 DAPI 溶液，用 1× PBS 溶液洗涤细胞两次。
- 在载玻片上滴加两滴封片介质，每滴 10 µL；确保两滴之间有足够的间距，以便在同一张载玻片上放置两个盖玻片。
- 用干净的纸巾轻拍盖玻片以去除多余液体，然后将盖玻片细胞面朝下置于抗荧光淬灭封片剂中。
- 将封片后的样品置于干燥、平坦的表面上，避光静置使其固化。
- 固化完成后，使用 VALAP 密封剂或指甲油封固盖玻片边缘，防止样品干燥。
2. 人呼吸道上皮细胞培养中的 SARS-CoV-2 RNA-FISH
第1天
- 固定和通透HAE培养物
- 吸除培养基，并使用3.7% PFA溶液在室温下固定感染的细胞1小时。
- 吸除3.7% PFA溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
- 在Transwell小室下方更换为1× PBS。
- 弃去PBS，使用预冷至-20 °C的100% MeOH进行两次、每次5分钟的洗涤以脱水样品。
- 第二次洗涤后，在Transwell小室下方更换为新鲜且预冷的MeOH，用于通透化处理，并于-20 °C过夜保存。
第2天
- 复水
在冰上使用梯度浓度的甲醇/PBST 溶液（每种溶液处理 5 分钟）对样品进行复水：75% 甲醇/25% PBST、50% 甲醇/50% PBST、25% 甲醇/75% PBST，以及 100% PBST（两次）。
- 在冰上用 50% 5x SSCT / 50% PBST 对细胞洗涤 5 分钟。
- 在冰上用 5x SSCT 对细胞洗涤 5 分钟。
- 将 5x SSCT 缓冲液替换为 1x PBS。
- 检测
- 将细胞（位于 Transwell 插件内）在冰上用 100 µL 探针杂交缓冲液孵育 5 分钟。随后将培养板转移至 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟（预杂交）。
注意：探针杂交缓冲液在使用前必须预热至 37 °C。计算所需体积：每个 Transwell 插件需要 100 µL。
- 配制探针溶液。由于每 1 mL 探针溶液需要 4 pmol 探针，因此将 4 µL 的 1 µM 探针储备液加入 1 mL 探针杂交缓冲液中，并充分混匀。
注意：用于 RNA 检测时，每个 Transwell 插件使用 100 µL 探针溶液。探针溶液在预杂交步骤结束前应始终置于冰上。
- 移除预杂交溶液，并加入探针溶液。
- 在 37 °C 下孵育细胞过夜（12–18 小时）。
第3天
- 在 37 °C 下用 100 µL 探针洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 15 分钟，以去除多余的探针。
- 在室温下用 5x SSCT 洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。
- 将 5x SSCT 替换为 1x PBS，并将样品在 4 °C 下保存至扩增步骤。
- 扩增
- 将样品与扩增缓冲液在室温下孵育 30 分钟，进行预扩增。
- 通过在独立的离心管中快速冷却所需体积的发夹探针来制备每个发夹探针。
- 制备 500 µL 扩增溶液时，每种发夹探针使用 30 pmol（例如，对于 500 µL 体系，使用 10 µL 的 3 µM 储存液）。
- 将发夹探针溶液转移至各离心管中。
- 在 95 °C 下孵育 90 秒。
- 避光冷却至室温，持续 30 分钟。
- 在室温下，将所有快速冷却后的发夹探针加入 500 µL 扩增缓冲液中，配制发夹探针溶液。
- 去除预扩增溶液，加入完整的发夹探针溶液。
- 在避光条件下于室温孵育过夜（12–18 小时）。
- 用 5x SSCT 在室温下洗涤以去除多余的发夹探针，具体步骤如下：2 次 × 5 分钟，2 次 × 15 分钟，1 次 × 5 分钟。
- 将 5x SSCT 溶液替换为 1x PBS，并在 4 °C 下保存不超过 2–3 天，或直接进行细胞核染色。
注意：如有需要，可将 RNA-FISH 样品用于标准免疫荧光检测，随后进行细胞核染色（见第 3 节）。
5. 细胞核染色与载玻片封片
- 吸去 1× PBS 溶液，加入含 DAPI 溶液（0.2 µg/mL）的 1× PBS。
- 将样品在室温避光条件下孵育 10 分钟。
- 吸去 DAPI 溶液，用 1× PBS 洗涤细胞两次。
- 将 Transwell 小室中切下的膜取出，细胞面朝上置于 10 µL 抗荧光淬灭封片剂上，并向膜上再添加 5 µL 封片剂。
- 用盖玻片覆盖膜。
- 将封片后的样品置于干燥、平坦的表面上，避光固化。
- 固化后，使用 VALAP 封片剂或指甲油密封盖玻片边缘，防止样品干燥。
3. Vero 细胞和 HAE 培养物的免疫荧光分析
注意：对于细胞系，在第3天进行免疫荧光检测；对于HAE培养物，则在第4天进行。每种模型采用不同的方法，所有差异均已明确标示。
- 从孔板中吸除 1x PBS 溶液。
- 用含 1% w/v 牛血清白蛋白的 PBST 溶液在 37 °C 下孵育 30 分钟，以封闭样品。
- 用封闭液配制适当稀释度的一抗溶液，并进行孵育。
- 对于盖玻片上的 Vero 细胞：
- 在湿盒内的 Parafilm 膜上滴加抗体溶液（30–50 µL）。
- 将盖玻片细胞面朝下置于抗体液滴上。
- 对于 HAE 样品，将插入式培养小室中的封闭液替换为抗体溶液（100 µL），并在湿盒中孵育样品。
注意：根据一抗的种类调整每次孵育的时间和温度。通常参数为室温孵育 2 小时或 4 °C 过夜。
- 用 PBST 溶液洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。
- 对于盖玻片上的细胞，将其转移至 12 孔板中，并加入 PBST 溶液。
- 对于 HAE 培养物，将抗体溶液替换为 PBST 溶液。
- 检查共聚焦显微镜可用的光源和滤光片。
- 根据一抗的宿主物种选择相应的二抗，并根据可用光源选择合适的荧光染料参数（激发和发射波长、光谱宽度及激发效率）。
注意： 可使用在线工具模拟光谱参数（参见 材料表）。
- 用封闭液稀释二抗，配制适当的二抗溶液。
- 孵育二抗（操作同步骤 6.3），但在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 按照步骤 3.4 的方法洗涤样品。
- 细胞核染色与载玻片封片
- 对于盖玻片上的细胞
- 吸除 PBST 溶液，加入含 DAPI（0.2 µg/mL）的 1x PBS 溶液。
- 在避光条件下室温孵育 10 分钟。
- 吸除 DAPI 溶液，用 1x PBS 洗涤细胞两次。
- 将盖玻片细胞面朝下置于含 10 µL 封片剂的液滴上。
- 用指甲油密封盖玻片。
- 对于 HAE 培养物
- 吸除 1x PBST 溶液，加入含 DAPI（0.2 µg/mL）的 1x PBS 溶液。
- 在避光条件下室温孵育 10 分钟。
- 吸除 DAPI 溶液，用 1x PBS 洗涤细胞两次。
- 将切割好的膜片细胞面朝上置于含 10 µL 封片剂的液滴上，并在膜片上额外添加 5 µL 封片剂。
- 用盖玻片覆盖膜片。
- 用指甲油密封盖玻片。
4. 共聚焦显微镜
- 通过指定所用的荧光染料来定义通道。
- 选择扫描模式和扫描速度。
- 通过与相应的阴性对照比较，调整每种荧光染料的激光功率、增益和偏移值：对于病毒，使用未感染的细胞作为对照；对于细胞蛋白，使用来自合适宿主的同型对照抗体染色的样品作为对照。
- 要获取三维图像，请启用z轴堆叠模式，并设定顶部和底部边界，设置步进大小/步数。
注意：有关冠状病毒成像的更多细节。