利用免疫-RNA 荧光原位杂交技术可视化 SARS-CoV-2

摘要

来源：Kula-Pacurar, A.，等。利用免疫RNA-荧光原位杂交技术对SARS-CoV-2进行可视化观察。J. Vis. Exp. (166), (2020)。

本视频演示了杂交链式反应（HCR）-荧光原位杂交（FISH）技术在可视化SARS-CoV-2亚基因组RNA空间分布中的应用。将HCR与免疫荧光技术相结合，有望在单细胞水平上揭示宿主与病毒之间的相互作用。

方案

1. 在盖玻片上培养的Vero细胞中进行SARS-CoV-2 RNA-FISH

第1天

1. 固定和通透细胞​
   1. 用3.7%（w/v）PFA溶液在室温下固定感染的细胞1小时。
   2. 吸除3.7% PFA溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
   3. 在室温下加入PBST溶液，振荡处理10分钟以通透细胞。
   4. 吸除PBST溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
2. 检测
   1. 吸除1× PBS溶液，用2× SSC在室温下洗涤细胞两次。
   2. 吸除2× SSC溶液，加入至少300 µL探针杂交缓冲液进行预杂交。盖上含有细胞的孔板，于37 °C孵育30分钟。
   3. 通过将1.2 pmol探针混合物加入探针杂交缓冲液中，制备探针溶液。
      1. 使用1.2 µL的1 µM探针储备液制备300 µL工作液。
   4. 移除预杂交液，将盖玻片转移至湿化 chamber 中。
      1. 将30–50 µL探针溶液滴加到Parafilm上，形成独立液滴。
   ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
共聚焦显微镜 LSM 880	ZEISS
Galaxy170R 培养箱	新不伦瑞克	CO170R-230-1000
材料
15 mm × 15 mm 1号盖玻片	LabSolute	7695022
1.5 mL 离心管	FL-MEDICAL	5.350.023.053
12孔板	TTP	92412
Alexa荧光素488标记的二抗	Invitrogen
β5-微管蛋白	Santa Cruz Biotechnology	sc-134234
DAPI	赛默飞世尔科技	D1306
HCR扩增缓冲液	Molecular Instruments, Inc	BAM01522	缓冲液也可参照 doi:10.1242/dev.165753：补充信息进行配制
HCR 放大器 B1-h1 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S013922
HCR 放大器 B1-h2 Alexa Fluor 647	Molecular Instruments, Inc.	S012522
HCR探针杂交缓冲液	Molecular Instruments, Inc.	BPH03821	缓冲液也可参照 doi:10.1242/dev.165753：补充信息进行配制
SARS-CoV-2 N 核衣壳蛋白 HCR 探针组	Molecular Instruments, Inc.	PRE134
HCR探针洗涤缓冲液	Molecular Instruments, Inc.	BPW01522	缓冲液也可参照 doi:10.1242/dev.165753：补充信息 进行配制
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免疫荧光（IF）	封闭	（含1% BSA的PBST）37 °C孵育30分钟
	一抗孵育	（用封闭液配制的适当浓度抗体溶液）室温孵育2小时，或4 °C过夜，用量30-50 µL	（用封闭液配制的适当浓度抗体溶液）室温孵育2小时，或4 °C过夜，每孔100 µL
	一抗洗涤	(PBST) 室温下洗涤 3 次，每次 5 分钟
	二抗孵育	（用封闭液配制的适当浓度抗体溶液）37 °C孵育1小时，30-50 µL	（用封闭液配制的适当浓度抗体溶液）37 °C孵育1小时，100 µL
	二抗洗涤	（PBST）室温下洗涤3次，每次5分钟
	细胞核染色	（DAPI 溶液）室温孵育 10 分钟，然后用 1× PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟