使用 Immuno-RNA 荧光原位杂交可视化 SARS-CoV-2

1. 在盖玻片上培养的 Vero 细胞中的 SARS-CoV-2 RNA-FISH

第 1 天

1. 固定和透化细胞
   1. 在 RT 下用 3.7% w/v PFA 溶液固定感染的细胞 1 小时。
   2. 吸出 3.7% PFA 溶液，并使用 1x PBS 洗涤细胞两次。
   3. 在 RT 下搅拌，用 PBST 溶液透化细胞 10 分钟。
   4. 吸出 PBST，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
2. 检波
   1. 吸出 1x PBS 溶液，并在 RT 下用 2x SSC 洗涤细胞两次。
   2. 吸出 2x SSC 溶液，并通过添加至少 300 μL 探针杂交缓冲液对样品进行预杂交。盖上含有细胞的孔，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 通过向探针杂交缓冲液中加入 1.2 pmol 探针混合物来制备探针溶液。
      1. 使用 1.2 μL 的 1 μM 探针原液制备 300 μL 的工作原液。
   4. 取出预杂交溶液，并将盖玻片转移到加湿室中。
      1. 将 30-50 μL 探针溶液移液到封口膜上以形成单独的液滴。
   5. 将样品在 37 °C 下孵育过夜（12-18 小时）。

第 2 天

1. 将盖玻片转移回 12 孔板中，并在 37 °C 下用 400 μL 探针洗涤缓冲液洗涤 4 x 5 分钟，去除多余的探针溶液><。 注意:作为将 30-50 μl 等分试样放在封口膜和盖玻片下进行孵育的替代方法，将 300 μL 探针溶液直接添加到 12 孔板中的盖玻片中。此过程更简单，但需要大量的试剂。使用前将探针洗涤缓冲液加热至 37 °C。计算所需的缓冲液量，并将其转移到 15 mL 锥形离心管中。
2. 在 RT 下用 5x SSCT 洗涤样品 2 x 5 分钟。
3. 用 1x PBS 替换 5x SSCT 溶液，并将样品储存在 4 °C 直至扩增。

3. 放大

1. 从孔中取出 1x PBS 溶液，并向每个孔中加入至少 300 μL 的扩增缓冲液。将样品在 RT 中孵育 30 分钟。
2. 通过在单独的试管中快速冷却所需体积来制备每个 HCR 发夹（h1 和 h2）。
   1. 要制备 300 μL 扩增溶液，每个发夹溶液使用 18 pmol（例如，对于 300 μL，使用 6 μL 的 3 μM 发夹溶液储备液）。
   2. 将发夹溶液转移到试管中。
   3. 在 95 °C 下孵育 90 秒。
   4. 在黑暗中冷却至 RT 30 分钟。
3. 通过将快速冷却的"h1"和"h2"发夹添加到扩增缓冲液中来制备发夹混合物。
4. 将 30-50 μL 发夹混合物滴到封口膜上。
5. 将样品在 RT 下在黑暗中孵育过夜（12-18 小时）。

第 3 天

6. 将盖玻片移回 12 孔板中，并在 RT 下用 5x SSCT 洗涤 5 x 5 分钟并搅拌，以去除多余的发夹。
7. 吸出 5x SSCT 缓冲液，并用 1x PBS 代替。
   注意:如果需要，在标准免疫荧光测定中使用 RNA-FISH 样品，然后对细胞核进行染色（参见第 1.4 节）。

4. 细胞核染色和玻片安装

1. 吸出 1x PBS 溶液，并在 1x PBS 溶液中用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.2 μg/mL）替换。
2. 将样品在 RT 下在黑暗中孵育 10 分钟。
3. 吸出 DAPI 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
4. 滴入两滴 10 μL 封固剂;确保液滴充分分离，以便将两个盖玻片放在一张载玻片上。
5. 用干净的毛巾轻敲盖玻片去除多余的液体，然后将它们放入抗淬灭封固剂中，细胞朝下。
6. 将封固的样品放在干燥、平坦的表面上避光，让它们固化。
7. 固化后，用 VALAP 密封剂或指甲油密封盖玻片的边缘，以防止样品变干。

2. HAE 培养物中的 SARS-CoV-2 RNA-FISH

第 1 天

1. 固定和透化 HAE 培养物
   1. 吸出培养基，并在 RT 下使用 3.7% PFA 溶液固定感染的细胞 1 小时。
   2. 吸出 3.7% PFA 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
      在
      1. Transwell 插入物下用 1x PBS 替换 3.7% PFA 溶液。
   3. 弃去 PBS，用 100% 预冷至 -20 °C 的 100% MeOH 洗涤 2 x 5 分钟脱水样品。
   4. 第二次洗涤后，用新鲜、冷冻的 MeOH 替换缓冲液，以便在 Transwell 插入管下透化。在 -20 °C 下储存过夜。

第 2 天

2. 补液
   在冰上通过一系列分级的 MeOH/PBST 溶液（每个 5 分钟）对样品进行再水化:75% MeOH/25% PBST、50% MeOH/50% PBST、25% MeOH/75% PBTS 和 100% PBST（两次）。
   1. 在冰上用 50% 5x SSCT/50% PBST 洗涤细胞 5 分钟。
   2. 用 5x SSCT 在冰上洗涤细胞 5 分钟。
   3. 用 1x PBS 替换 5x SSCT 缓冲液。
3. 检波
   1. 将细胞（在 Transwell 插入管内）在 100 μL 探针杂交缓冲液的冰上孵育 5 分钟。接下来，将板转移至培养箱中，在 37 °C 下培养 30 分钟（预杂交><）。 注意: 探针杂交缓冲液在使用前必须预热至 37 °C。计算所需体积:单个 Transwell 插入片段需要 100 μL。
   2. 准备探针溶液。由于 1 mL 探针溶液需要 4 pmol 探针，因此将 4 μL 1 μM 探针储备液添加到 1 mL 探针杂交缓冲液中，并充分混合><。 注意:对于 RNA 检测，每个 Transwell 插入片段使用 100 μL 探针溶液。将探针溶液留在冰上，直到预杂交步骤结束。
   3. 去除预杂交溶液，并添加探针溶液。
   4. 将细胞在 37 °C 下孵育过夜（12-18 小时）。

第 3 天

5. 通过在 37 °C 下用 100 μL 探针洗涤缓冲液洗涤 4 x 15 分钟来去除多余的探针。
6. 在 RT 下用 5x SSCT 洗涤样品 2 x 5 分钟。
7. 用 1x PBS 替换 5x SSCT，并将样品储存在 4 °C 直至扩增。

4. 放大

1. 通过在 RT 下将样品与扩增缓冲液孵育 30 分钟来预扩增样品。
2. 通过在单独的试管中快速冷却所需的体积来准备每个发夹。
   1. 要制备 500 μL 扩增溶液，每个发夹溶液使用 30 pmol（例如，对于 500 μL，使用 10 μL 3 μM 发夹液储备液）。
   2. 将发夹溶液转移到试管中。
   3. 在 95 °C 下孵育 90 秒。
   4. 在黑暗中冷却至 RT 30 分钟。
3. 通过在 RT 下将所有快速冷却的发夹添加到 500 μL 扩增缓冲液中来制备发夹溶液。
4. 去除预扩增溶液，加入完整的发夹溶液。
5. 将样品在 RT 中黑暗孵育过夜（12-18 小时）。
6. 通过在室温下用 5x SSCT 洗涤去除多余的发夹，如下所示:2 x 5 分钟、2 x 15 分钟和 1 x 5 分钟。
7. 用 1x PBS 替换 5x SSCT 溶液，并在 4 °C 下储存不超过 2-3 天，或直接进行核染色><。 注意: 如果需要，在标准免疫荧光测定中使用 RNA-FISH 样品，然后进行核染色（参见第 3 节）。

5. 细胞核染色和玻片封片

1. 吸出 1x PBS 溶液，并用 1x PBS 中的 DAPI 溶液 （0.2 μg/mL） 替换。
2. 将样品在 RT 下在黑暗中孵育 10 分钟。
3. 吸出 DAPI 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
4. 将 Transwell 插入物中的切割膜放在 10 μL 抗淬灭封固剂上，细胞朝上，并向膜上添加额外的封固剂 （5 μL）。
5. 用盖玻片盖住膜。
在
6. 黑暗中将封片样品放在干燥、平坦的表面上固化。
7. 固化后，用 VALAP 密封剂或指甲油密封盖玻片的边缘，以防止样品变干。

3. Vero 细胞和 HAE 培养物的免疫荧光分析

注意:对于细胞系，在第 3 天进行免疫荧光测定，对于HAE培养物，在第 4 天进行免疫荧光测定。对每个模型使用不同的方法。所有差异都清楚地表明。

1. 从孔中吸出 1x PBS 溶液。
2. 通过在 37 °C 下与 1% w/v 牛血清白蛋白在 PBST 溶液中孵育 30 分钟来封闭样品。
3. 通过在封闭溶液中制备适当稀释液来制备一抗，然后孵育。
   1. 对于盖玻片上的 Vero 细胞:
      1. 将抗体溶液滴 （30-50 μL） 滴到湿度室中的封口膜上。
      2. 将盖玻片放在抗体滴上，细胞朝下。
   2. 对于 HAE，用抗体溶液 （100 μL） 替换插入物中的封闭剂，并在加湿室中孵育样品><。 注:调整每次与一抗孵育的时间和温度。典型参数是在 RT 下 2 小时或在 4 °C 下过夜。
4. 用 PBST 洗涤样品 3 x 5 分钟。
   1. 对于盖玻片上的细胞，转移到 12 孔板中并加入 PBST 溶液。
   2. 对于 HAE 培养物，用 PBST 溶液替换抗体溶液。
5. 检查可用于共聚焦显微镜的光源和滤光片。
6. 根据宿主物种选择二抗。选择荧光基团参数（根据可用光源的激发和发射波长、光谱宽度和激发效率）。
   注意:可以使用在线工具对光谱参数进行建模（参见材料表）。
7. 用封闭溶液稀释，制备合适的二抗溶液。
8. 与二抗孵育（如 6.3），但在 37 °C 下孵育 1 小时。
9. 按照步骤 3.4 洗涤样品。
10. 细胞核染色和玻片安装
    1. 对于盖玻片上的细胞
       1. 吸出 PBST，并在 1x PBS 溶液中用 DAPI （0.2 μg/mL） 替换它。
       2. 将样品在 RT 下在黑暗中孵育 10 分钟。
       3. 吸出 DAPI 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
       4. 将盖玻片放在 10 μL 封固剂滴上，细胞朝下。
       5. 用指甲油密封盖玻片。
    2. 用于 HAE 培养
       1. 吸出 1x PBST，并在 1x PBS 溶液中用 DAPI（0.2 μg/mL）替换它。
       2. 将样品在 RT 下在黑暗中孵育 10 分钟。
       3. 吸出 DAPI 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。
       4. 将切割膜滴在 10 μL 封片剂上，细胞朝上，并在膜上添加额外的 （5 μL） 封固剂。
       5. 用盖玻片盖住膜。
       6. 用指甲油密封盖玻片。

4. 共聚焦显微镜

1. 通过指定使用的荧光基团来定义轨迹。
2. 选择扫描模式和速度。
3. 通过将每个荧光团与相应的阴性对照进行比较来调整每个荧光团的激光功率、增益和偏移值:对于病毒，模拟感染的细胞;对于细胞蛋白，用来自适当宿主的同种型对照抗体染色的样品。
4. 要获取 3D 图像，请激活 z 堆栈模式，并设置上限和下限。设置步长/数字。
   注意:有关冠状病毒成像的更多详细信息。