一种用于测定人血清中中和抗体滴度的微量中和实验

来源：Gross, F. L. 等，利用MDCK-SIAT1细胞微量中和实验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用过表达与α2,6连接的唾液酸的人类血清中的Madin-Darby犬肾细胞进行微量中和试验，以检测中和抗体。该试验常用于流感的人类血清学研究。

所有流感病毒的操作均应根据《微生物和生物医学实验室生物安全》（BMBL）中规定的相应生物安全等级要求（BSL-2 或更高）进行。

1. 试剂与起始材料的准备

准备Madin-Darby犬肾细胞α2,6-唾液酸转移酶（MDCK-SIAT1）细胞和无菌细胞培养基
1. 制备 MDCK-SIAT1 细胞培养基 使用500 mL高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），含10% v/v热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1 mg/mL G418硫酸盐例如，遗传霉素），以及100 U/ml青霉素和100 µg/mL 链霉素（可选）。通过 0.2 μm 滤膜过滤除菌 µM孔径膜。添加G418硫酸盐以确保质粒在MDCK-SIAT1细胞中的稳定性。
2. 制备 MDCK-SIAT1 细胞系。在162 cm²培养瓶中²- 含有30 mL无菌细胞培养基的组织培养瓶，接种瓶时细胞密度为2 - 2.5 × 10⁶ cells/mL⁶ MDCK-SIAT1 细胞并在 37 °C，5% CO₂₂ 2天；该样本将用于组织培养感染剂量（TCID）测定和中和试验（MN assays）。
  注意： MDCK-SIAT1 细胞由德国马尔堡的 M. Matrosovich 博士惠赠。该细胞系也可通过商业途径获得（参见 材料表).
制备 无菌病毒增殖培养基 使用500 mL DMEM高糖培养基，含0.3%牛血清白蛋白（BSA）V组分、100 U/mL青霉素、100 µg/mL 链霉素，20 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）。通过 0.2 μm 滤膜过滤除菌 µM 孔径膜
制备 0.75% (v/v) 豚鼠红细胞（gpRBCs） 在含有 0.01 M PBS、pH 为 7.2 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
制备 无菌病毒稀释液 使用含高糖DMEM、1% 牛血清白蛋白第五组分（BSA）、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 20 mM HEPES。使用 0.2 μm 滤膜过滤除菌 µm孔径膜，每次检测均需新鲜配制。
制备 冷细胞固定剂 PBS（0.01 M PBS，pH 7.2）中的80%冷丙酮
制备 洗涤缓冲液 使用 PBS（0.01 M PBS，pH 7.2）和 0.3%（v/v）Tween-20。
制备 抗体稀释液 使用 PBS（0.01 M PBS，pH 7.2）、0.3%（v/v）Tween-20 和 5% 脱脂奶粉。
使用抗流感病毒A型核蛋白小鼠单克隆抗体克隆A1和A3混合物作为一抗用滴定确定的最佳浓度，在抗体稀释液中进行稀释。
使用与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG作为二抗用滴定确定的最佳浓度，在抗体稀释液中进行稀释。
制备 过氧化物酶底物 使用 o邻苯二胺二盐酸盐（OPD）溶于 pH 5 的 0.05 M 磷酸柠檬酸缓冲液中。通过将 1 粒胶囊溶于 100 mL 去离子水制备 0.05 M 磷酸柠檬酸缓冲液₂O. 使用前立即用20 mL磷酸柠檬酸缓冲液溶解1片OPD片（10 mg）。
使用0.5 M的硫酸作为 OPD终止液. 将28 mL的18 M浓硫酸加入972 mL去离子H₂在化学通风橱中进行。
人和动物血清的处理
1. 热灭活 人血清 在56℃水浴中用于微核试验 °在检测前于 30°C 孵育 30 分钟。应立即使用，若需保存，可将解冻后的血清置于 4°C °C，不超过24小时；若需更长时间保存，请将血清于-20℃冷冻保存 °C 或更低温度。
2. 处理 动物血清 在进行微量中和试验（MN试验）前，需使用受体破坏酶（RDE）处理并加热灭活，具体步骤如下。
  1. 在37℃下解冻血清 ˚C水浴中孵育，然后置于冰上。将1体积的动物血清样本与3体积的RDE混合，在37℃孵育 ˚C，18 - 20 小时。
  2. 将经 RDE 处理的血清在 56 ℃ 下热灭活 ˚C 反应 30 分钟。向每个样本中加入 6 倍体积的 PBS（pH 7.2），使最终预稀释比例为 1:10。如需保存，将解冻后的血清置于 4 °C，不超过24小时；若需更长时间保存，请将血清在-20℃冷冻保存 °C 或更低温度
    注意： 动物血清可能含有多种唾液酸聚糖，这些聚糖可与流感病毒的血凝素（HAs）结合，从而抑制流感特异性抗-HA抗体与HA的结合。因此，在进行中和试验（MN试验）前，必须使用RDE处理所有动物血清，以去除血清样本中这些非特异性的病毒HA结合物。

2. MDCK-SIAT1 细胞培养的传代

注意：所有细胞培养操作必须在生物安全柜中进行，以防止污染。

从162 cm² 培养瓶中的细胞单层中倾去培养基。用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗细胞单层进行消化。每瓶加入5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞单层，于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育，直至细胞单层脱落（5–10分钟）。向每瓶含消化后细胞的培养瓶中加入15 mL MDCK-SIAT1细胞培养基，用移液器反复吹打使细胞充分分散。
使用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量和活率。将细胞以每瓶2–2.5 × 10⁶ 个细胞的密度接种至含30 mL培养基的新162 cm² 组织培养瓶中，于37 °C、5% CO₂ 条件下培养2天，用于组织培养感染剂量（TCID）和中和试验（MN assay）。为用于病毒扩增，将细胞以每瓶4–5 × 10⁶ 个细胞的密度接种，于37 °C、5% CO₂ 条件下培养2天。
注意： 若需缩短或延长培养时间，可相应调整接种密度。进行病毒扩增时，细胞应达到超过100%的汇合度；进行组织培养感染剂量（TCID）和中和试验（MN assay）时，细胞汇合度应为75–95%（图1）。

3. 在 MDCK-SIAT1 细胞中扩增 A(H3N2) 病毒

注意：A(H3N2) 病毒可通过标准方案在 10 至 11 日龄的鸡胚中增殖，也可在 MDCK-SIAT1 细胞培养物中进行。用于接种病毒时，MDCK-SIAT1 细胞应达到超过 100% 的汇合度。病毒种子储备液可使用不同稀释度的接种物进行接种。收获后血凝活性（HA）和感染性最佳的接种物稀释度可用于后续的微量中和（MN）试验。

从162 cm²培养瓶中已形成单层（>100%融合度）的细胞中移除细胞培养基。用15 mL无菌0.01 M PBS（pH 7.2）洗涤单层细胞两次，然后弃去液体。
将1个培养瓶标记为对照组，加入20 mL病毒增殖培养基。将该培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。此瓶不进行任何操作，用于病毒增殖第1天后的比较。
向培养瓶中加入10 mL无菌病毒增殖培养基，并将所有培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。在室温下解冻一管流感病毒储备液，随后置于冰上。用病毒增殖培养基稀释至目标稀释度。
注意：目标稀释度可根据病毒储备液的血凝（HA）滴度进行调整。制备1:1000稀释的接种物时，将100 µL病毒加入9.9 mL无菌病毒增殖培养基中，轻轻颠倒混匀；取1 mL该1:100稀释液加入9 mL无菌病毒增殖培养基中，再次轻轻颠倒混匀，得到1:1000稀释的接种物。置于冰上备用。
将除对照瓶外的所有培养瓶从孵育箱中取出。移除MDCK-SIAT1细胞培养瓶中的病毒增殖培养基，每瓶接种10 mL稀释后的病毒液。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时，每隔15分钟轻轻旋转一次培养瓶。
从培养瓶中移除5 mL接种液，替换为15 mL含有1 µg/mL甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮处理的胰蛋白酶（TPCK-胰蛋白酶）的无菌病毒增殖培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育16–18小时。
过夜孵育后，在100倍显微镜下观察培养瓶，检查细胞是否存在细胞病变效应（CPE）。从培养瓶中移除15–17 mL病毒上清液，并替换为15–17 mL新鲜配制的含有2 µg/mL TPCK-胰蛋白酶的病毒增殖培养基。
将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育。通过与细胞对照瓶比较，监测单层细胞的CPE，并使用0.75%鸡红细胞（gpRBC）定期（每4小时）检测血凝活性（HA），直至收获病毒。
1. 准备一块96孔微量血凝板。在A2–A12和B2–B12孔（设重复）以及H1–H12孔（对照）中各加入50 µL 0.01 M PBS（pH 7.2）。
2. 在A1和A2孔中各加入100 µL病毒上清液，从A1和B1孔开始进行2倍系列稀释至A12和B12孔。在A12和B12孔混匀后弃去50 µL。向A、B和H行各孔中加入50 µL 0.75% gpRBC悬液。
3. 轻敲血凝板，室温孵育1小时。
  1. 将96孔微量血凝板倾斜至45°至60°角，观察病毒上清液的血凝活性。
  2. 读取血凝结果：能够完全引起血凝的病毒最高稀释度即为该病毒的HA滴定终点。将完全血凝的最高病毒稀释度的倒数记录为该病毒的HA滴度。
    注意：对照行H中的红细胞在重力作用下应开始“流动”，形成小泪滴状。待对照孔中红细胞完全流动后，再读取病毒滴定孔中的红细胞沉淀情况。若红细胞形成沉淀并发生“流动”，则未发生血凝。确定完全抑制血凝的病毒最高稀释度，作为该病毒的终点HA滴度。
当病毒培养物的HA值达到平台期或达到目标HA值（例如，>16 HA单位）时，但在细胞单层尚未出现明显CPE之前，收获病毒。
1. 将病毒培养上清液在4 °C条件下以300 x g离心10分钟，以沉淀细胞碎片。将澄清的上清液（含收获的病毒）转移至洁净离心管中。将含病毒的上清液分装至一次性无菌冻存管中，立即在-70 °C或更低温度下冷冻保存。
  注意：用于中和试验（MN assay）的病毒储备液应具有高感染性滴度且缺陷颗粒最少。用于MN试验的病毒储备液最低稀释度应为1:100，以达到每50 µL含100 TCID₅₀。
  注意：用于MN试验的病毒储备液不得反复冻融。

4. 病毒TCID的测定

第1天：病毒滴定
1. 室温下解冻一管病毒，立即置于冰上。
2. 在两种不同的起始稀释度下检测病毒：10^-2 和 10^-3. 加入100 µ将病毒液 L 加入 9.9 mL 病毒稀释液中，稀释 10 倍^-2 稀释。加入1 mL的10^-2 稀释至9.0 mL病毒稀释液，用于10倍稀释^-3 稀释
3. 使用两块微量滴定板（1号板用于10^-2 稀释并接种2号平板，稀释倍数为10^-3 稀释），加入100 µ除96孔微量滴定板的第1列外，向其余各孔加入病毒稀释液。
4. 执行 ½对数₁₀稀释（10^-2, 10^-2.5, 10^-3, 等等。）。加入146 µ将病毒起始稀释液各 46 L 加入第 1 列所有孔中，并转移 46 µL 从第1列依次至第11列（图2）。每次更换孔时需更换移液器吸头。混合第11列后，将吸头连同残留液体一并弃置 µL 稀释。
5. 将第12列用作细胞对照（CC），其中仅含有病毒稀释液。在37℃孵育1小时。 °C，5% CO_2.
第1天：MDCK-SIAT1细胞的制备
注意： MDCK-SIAT1 细胞单层应达到 75 - 95% 汇合度，用于 TCID 和 MN 检测。一个 162 cm² 培养瓶² 95% 汇合度的培养瓶应能提供足够的细胞，可接种约 4 - 5 块微孔板。
1. 用 20 mL PBS 清洗 75–95% 汇合度的单层细胞，以去除培养基中的 FBS。按如下步骤对细胞进行胰蛋白酶消化。
  1. 用无菌 PBS 洗涤单层细胞，加入 7 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液覆盖细胞单层。将培养瓶放平，于 37 °C 培养 °C，5% CO₂直至单层细胞脱落（约5 - 10分钟）。向每瓶含有胰蛋白酶消化细胞的培养瓶中加入7 mL病毒稀释液。
2. 用病毒稀释液洗涤细胞，以去除胎牛血清（FBS）。
  1. 轻轻吹打混匀以分离细胞。将细胞转移至50 mL锥形管中，用病毒稀释液充满该管。
  2. 在 485 × g 下离心 5 分钟。倾去病毒稀释液，加入新鲜的 50 mL 病毒稀释液，再在 485 × g 下离心 5 分钟。倾去病毒稀释液，加入新鲜病毒稀释液（10 mL/瓶）重悬沉淀。
3. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量和活力。用病毒稀释液将细胞浓度调整至 1.5 x 10⁵cells/mL
4. 加入100 µ将稀释的MDCK-SIAT1细胞悬液各1.5 × 10⁵个细胞加入微孔板的每个孔中⁴细胞/孔），盖好培养板。在37℃下孵育 °C，5% CO₂ 18 - 20 小时。
第2天：ELISA
1. 细胞固定
  1. 从微量滴定板中移除培养基。每孔用 200 µL 的 PBS。加入 300 µ向每孔加入预冷的80%丙酮，室温孵育10分钟。去除固定液，使板子自然晾干。
2. 酶联免疫吸附测定
  1. 一抗孵育
    注意： 抗流感病毒A型NP单克隆抗体应作为ELISA中的过量一抗使用。通过在MN中进行抗体滴定，确定每批一抗的最佳稀释度。选择处于过量状态且信噪比最佳的一抗浓度。
    1. 将抗流感病毒A型NP单克隆抗体（一抗）用抗体稀释液稀释至目标浓度（例如加入30 µ将1:1000稀释比例的30 mL一抗稀释液加入L型一抗中。
    2. 用 300 洗涤平板 3 次 µ洗脱缓冲液。加入100 µ将稀释的一抗加入各孔中，室温孵育1小时。
  2. 二抗孵育
    注意： 山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG（与辣根过氧化物酶HRP偶联）应作为ELISA中的二抗过量使用。通过进行抗体滴定实验，确定每批二抗的最佳稀释度。选择信号与背景比最优且过量的二抗浓度。
    1. 将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG抗体（二抗）用抗体稀释液稀释至目标浓度（例如加入7.5 µ将二抗加入30 mL抗体稀释液中，达到目标稀释比例1:4000。
    2. 用 300 洗涤平板 3 次 µL 洗涤缓冲液。加入 100 µ向每孔加入稀释的二抗。室温孵育1小时。
  3. 底物添加与酶标仪读数
    1. 用 300 洗涤平板 5 次 µL 洗涤缓冲液，并在无绒布上轻拍。
    2. 加入100 µ向每个孔中加入新鲜配制的底物溶液 L，室温孵育至显色完全，且细胞对照孔的光密度（OD）值达到饱和 <0.2.
    3. 加入100 µ向所有孔中加入终止液 L。使用酶标仪在 490 nm 处读取各孔的吸光度。
半数组织培养感染剂量 ₅₀ 计算
1. 计算中位数OD₄₉₀ 细胞对照（第12列）。
2. 将任何测试孔的吸光度（OD）视为₄₉₀ 大于中位数OD的两倍₄₉₀ 将CC孔的结果判读为“阳性”；否则，判为“阴性”。
3. 计算 TCID₅₀ 使用Reed-Muench法测定病毒滴度。
  1. 确定每个稀释度下的阳性数和阴性数。
  2. 计算“累积阳性”、“累积阴性”、“比值”和“阳性百分比”，如图所示。表1.
  3. 计算显示稀释度之间的“比例距离” >50% 阳性及显示稀释度 <50% 阳性，使用以下方法：
    
    注意： 校正因子为 ½ log稀释倍数为0.5。例如，在表1(80 − 50)/(80 − 20) × 0.5 = 0.25
  4. 计算病毒 TCID₅₀ 通过将成比例的距离加到显示稀释度的位置 > 50% 阳性。
    注意： 例如，在表2，半数组织培养感染剂量₅₀ 是10^-5+(-0.25)= 10^-5.25. 注意，这是TCID₅₀ 每100个病毒 µL（或10^-5.25/100 µL)
4. 计算病毒稀释度。对于中和试验（MN试验），将病毒稀释至200 TCID₅₀/100 µL（相当于100 TCID）₅₀/50 µ每孔 L
  注意： 在以下示例中表1，1 TCID₅₀ 是10^-5.25 在 100 µL，以及为达到200 TCID的稀释倍数₅₀/100 µL 为 1:891，依据以下计算：200 × 10^-5.25= 10^-2.95= 1/10^2.95= 1/891

使用 MDCK-SIAT1 细胞进行中和试验

第1天：测试血清与对照血清的制备及板式布局
1. 在37 °C水浴中解冻血清，解冻后立即取出。分装待测血清量；每种病毒单次检测至少需要10 µL原始血清。如有可能，血清应设复孔检测。
2. 将人血清在56 °C水浴中加热灭活30分钟，操作同步骤1.12.1。加热灭活后立即将血清置于冰上，并加入病毒稀释液，使血清预稀释至1:10。
3. 按照1.12.2节方法对动物血清进行RDE处理，并预稀释至1:10作为对照使用。
  注意：解冻并处理后的人血清和动物血清可在4 °C保存不超过24小时。若需更长时间保存，则应在-20 °C或更低温度下冷冻保存，直至进行检测。
4. 检测一种病毒时，向A1至A10列各孔中加入100 µL 1:10稀释的血清（图3）。除第11和第12列外，向B至H行各孔中加入50 µL病毒稀释液（图3）。从A行至H行进行2倍系列稀释，H行最后一孔弃去50 µL（图3）。
  注意：当需检测多种病毒时，可先在滴度管中对血清进行稀释。用于确定血清滴度的各孔稀释比例为：A孔1:10，B孔1:20，C孔1:40，D孔1:80，E孔1:160，F孔1:320，G孔1:640，H孔1:1,280（图3）。
5. 病毒对照组：向A12、B12、C12和D12孔中各加入50 µL病毒稀释液（无血清）。细胞对照组：向E12、F12、G12和H12孔中各加入100 µL病毒稀释液（无病毒、无血清）。
6. 对于对照血清（例如雪貂血清对照），向第11列A孔中加入100 µL稀释后的对照血清，并向B11至H11孔中各加入50 µL病毒稀释液，随后进行系列稀释。
7. 盖好板，于37 °C、5% CO₂条件下孵育，直至准备加入病毒。
第1天：病毒加入
1. 用病毒稀释液将病毒稀释至100 TCID₅₀/50 µL。
2. 向所有孔中加入50 µL稀释后的病毒，但回滴定（BT）板的第11列以及所有板上的细胞对照孔E12、F12、G12和H12除外（图3）。对于第11列含有对照血清的板，需向第11列加入病毒。
3. 回滴定（BT）
  1. 在一组复孔板的第11列中进行回滴定（例如板1A和1B）。向第11列所有孔中加入50 µL病毒稀释液。向第一孔（A11）中加入50 µL浓度为100 TCID₅₀/50 µL的病毒，通过移液器反复吹打混匀。
  2. 混匀后吸取50 µL转移至下一孔，进行2倍系列稀释。每换一孔均需更换枪头，以防病毒交叉污染。从H11孔弃去50 µL液体。
  3. 向第11列各孔再加入50 µL病毒稀释液，使最终体积达到100 µL。轻敲板面以充分混匀。
4. 将板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
5. 第1天进行MDCK-SIAT1细胞接种，第2天进行ELISA检测，具体操作见步骤4.2和4.3（也见5.3和5.4节）。
第1天：MDCK-SIAT1细胞接种
1. 按步骤4.2所述方法准备MDCK-SIAT1细胞。向每孔加入100 µL浓度为1.5 x 10⁵ cells/mL的MDCK-SIAT1细胞（即每孔1.5 x 10⁴个细胞）。将板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育18–20小时。
第2天：ELISA检测
1. 过夜孵育后，于第二天按步骤4.3所述方法用80%冷丙酮固定细胞。
2. 一抗加入
  1. 用300 µL洗涤缓冲液洗板3次。将抗流感A型NP单克隆抗体（一抗）用抗体稀释液稀释至最适浓度（根据滴定结果确定）（例如，将30 µL一抗加入30 mL抗体稀释液中，得到1:1000的目标稀释度）。
    注意：每孔需加入100 µL稀释后的一抗。每块板约需10 mL。
  2. 向每孔加入100 µL稀释后的一抗，室温孵育1小时。
3. 二抗加入
  1. 用300 µL洗涤缓冲液洗板3次。将HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（二抗）用抗体稀释液稀释至目标浓度（例如，将7.5 µL二抗加入30 mL抗体稀释液中，得到1:4000的目标稀释度）。
    注意：每96孔板每孔需100 µL二抗，每块板约需10 mL。
  2. 向每孔加入100 µL稀释后的二抗，室温孵育1小时。
4. 底物加入与读板
  1. 用300 µL洗涤缓冲液洗板5次，并在无绒布上轻拍去除残留液体。
  2. 向每孔加入100 µL新鲜配制的底物溶液，室温孵育，直至病毒对照孔的OD₄₉₀达到0.8–3，同时细胞对照孔的背景OD₄₉₀<0.2。
  3. 向所有孔中加入100 µL终止液。使用酶标仪在490 nm波长下读取各孔的吸光度值。
数据分析
注意：中和试验（MN）的计算需对每块板单独进行。
1. 确定每份血清样本的中和抗体滴度。
  1. 使用以下公式计算每块板50%病毒中和的OD₄₉₀阈值：
    
    注意：此处x表示50%中和阈值。对应于OD₄₉₀低于阈值50%（即≥50%抑制率）的最高稀释倍数的血清稀释倒数，即为该血清样本的中和抗体滴度（图4）。
2. 确认细胞对照孔的OD₄₉₀<0.2，病毒对照孔的OD₄₉₀ = 0.8–3。
3. 通过病毒回滴定（BT）验证每次实验中病毒的感染性（100x TCID₅₀）。BT的可接受范围为50、100或200 TCID。若采用与步骤4.4.2中相同的阈值，则BT列中OD高于阈值的最高病毒稀释度应出现在E11、F11和G11孔。
  注意：阳性血清对照的滴度应与前次实验结果在2倍范围内。阴性血清对照的OD₄₉₀应与病毒对照相近。

姓名	公司	目录编号	评论
高糖改良型达尔伯克氏必需培养基（DMEM）	Life Science	11965	无菌细胞培养、病毒增殖和病毒稀释培养基的关键组分
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30070.03
牛血清白蛋白（BSA）V组分，无蛋白酶	Sigma-Aldrich	3117332001
L-谷氨酰胺	Life Science	25030-081
丙酮酸钠	Life Science	11360-070
遗传霉素G-418硫酸盐	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Life Science	15630-080
青霉素/链霉素	Life Science	15140-122
丙酮	VWR	67-64-1	使用浓度为80%
含过硼酸钠的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
邻苯二胺二盐酸盐片剂	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	每100 ml细胞培养级水中加入1片
硫酸	Fisher Scientific	A510-P500	终浓度为0.5 M
变性乙醇，4L	VWR	EM-AX0422-3	使用浓度为70%
胰蛋白酶-EDTA	Life Science	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
吐温20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
抗NP小鼠单克隆抗体	Millipore pool	MAB 8257 MAB 8258
抗小鼠IgG HRP	KPL	074-1802
96孔平底板	Thermo Scientific	3455
酶标仪	Molecular Device	Spectromax 384 plus
细胞培养瓶，162 cm²，带透气盖	Corning/VWR	3151

一种用于测定人血清中中和抗体滴度的微量中和实验

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