一种检测氧化爆发的实验方法 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

摘要

来源：Bredow, M., 等 模式触发的氧化爆发及幼苗生长抑制实验 拟南芥. J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了一种检测拟南芥（Arabidopsis）叶片在免疫激发后氧化爆发的实验方法。从植物叶片上切取叶圆片，与作为微生物相关分子模式（MAMPs）的细菌多肽共同孵育。当植物细胞识别MAMPs后，会诱导产生活性氧（ROS），通过化学发光法检测胞外ROS的生成。

方案

1. 检测ROS爆发 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

1. 植物生长与养护
   1. 为同步萌发，进行层积处理 拟南芥 将约50粒种子悬浮于1 mL无菌0.1%琼脂溶液（w/v）中，于4 °C（避光）保存3–4天。
      注意： 将野生型背景对照（例如，Col-0）以及免疫响应高和低的基因型进行分层（例如， cpk28-1 和 bak1-5, 分别作为内参对照。
   2. 将种子播种于土壤中，并在标准短日照条件下（22 °C，10 小时光照，150 μE/m²/s）萌发²/光照强度，以及65-70%的相对湿度）。
   3. 约7天后，用镊子将单株幼苗移栽至新花盆中，株间距至少4厘米，以保证莲座叶充分发育。每种基因型移栽6–12株幼苗，并恢复至标准短日照条件下培养。定期浇水并施肥（每两周施用一次浓度为1 g/L的20-20-20肥料）。
2. 将叶盘收集至96孔板中，过夜恢复。
   1. 在萌发后4-5周（图1A），使用锋利的4 mm活检打孔器从每株植物上取一片叶圆片，避开主脉，并注意尽量减少机械损伤 （图1B）将叶圆片放入一个未使用过的96孔化学发光检测仪板中，每孔加入100 μL双蒸水（ddH₂O）。₂O），近轴面朝上放置，以防止干燥 （图1C）若需评估多种激发子，应从同一片叶子上为每种激发子处理各取一个叶圆片。
      注意： 选取完全展开、位于莲座顶端第3至第5位、大小和年龄相近的叶片，以减少变异性。如有可能，在过夜恢复前用剃刀片将叶圆片切成两半，以增加其暴露于诱导剂溶液的表面积。
   2. 在室温下过夜恢复，以避免叶片圆片采集过程中因损伤产生的活性氧干扰。用盖子盖住培养板以防止蒸发。
3. 进行诱导剂处理并检测ROS的产生。
   1. 在加入反应溶液前预先设置好酶标仪，以减少活性氧爆发启动与首次记录测量值之间的时间。使用与酶标仪匹配的商用软件。在本实验中（见 目录），点击 设置，然后选择 LUM96 盒式与 动力学 读取类型。点击 读取区域 类别并拖动以选择要读取的部分孔或整块孔板。在下方 PMT与光学系统 选项卡中，将积分时间设置为 1,000 ms。在 时间安排 标签，设置 总运行时间 40-60 分钟 间隔 至 2 分钟。
   2. 使用多通道移液器从每个孔中移除水分。
      注意： 不要刺穿叶片圆片，以免造成损伤应激，导致活性氧（ROS）产量出现更大变异。
   3. 配制反应溶液，其中包含 100 μM 鲁米诺、10 μg/mL 辣根过氧化物酶 (HRP) 以及所需浓度的诱导子（例如：elf18 浓度为 1 nM、10 nM、100 nM 或 1,000 nM），溶于无菌 ddH₂O 中₂使用10 mL溶液用于一个96孔板。
      注意： 将冻干肽溶解于无菌 H₂在低吸附离心管中配制成10 mM母液，液氮速冻₂，并在 -80 °C 下保存。使用前，用无菌 H₂O，配制100 μM的工作液，于-20 °C保存。
   4. 使用多通道移液器将100 μL反应混合物加入每个孔中，同时将溶液添加到同一种处理组的所有叶盘中。为每种基因型设置一个对照反应（不加诱导子），以评估无诱导条件下的基础活性氧（ROS）水平。立即使用酶标仪检测可见光谱范围内所有波长的发光信号。
      注意： 在弱光条件下配制和使用反应液，因为鲁米诺和辣根过氧化物酶对光敏感。试剂在不使用时应置于冰上或-20°C保存。
   5. 在40至60分钟内，使用酶标仪以2分钟间隔、1,000毫秒积分时间测量光信号，以捕获动态氧化爆发 （图1D）.
      注意： 使用较长的积分时间以提高检测灵敏度，同时确保96孔板中的所有样品均能在同一时间间隔内完成测量。

结果

图1. 免疫诱导后基于鲁米诺的氧化爆发检测法（Arabidopsis）。（A）在短日照条件下于土壤中培养植物4-5周。（B）使用4 mm活检打孔器从每株植物采集叶片圆片，并在ddH₂O中过夜恢复。（C）加入反应溶液（100 μM luminol、10 μg/mL HRP以及所需浓度的激发子），在40-60分钟内以2分钟间隔、1,000 ms积分时间测量光信号发射。（D）相对于Col-0（绿色所示）、高ROS对照（如cpk28-1，紫色所示）和低ROS对照（如bak1-5，橙色所示），确定每种基因型的平均光子数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20-20-20肥料	Plant Prod	10529	将1 g/L溶于水中，每2周施用于植物一次，以获得最佳生长效果。
4 mm活检打孔器	Medical Mart	232-33-34-P	也可使用截面积为0.125 cm²的打孔器套装。
BioHit mLine机械式12通道移液器（30-300 µL）	Sartorius	725240	可使用任何多通道移液器，必要时也可使用单通道移液器。
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	将10 mM储备液肽存于-80°C的低蛋白吸附管中。解冻后，将100 µM工作液存于-20°C，避光保存。
镊子	Fisher Scientific	22-327379
辣根过氧化物酶	Sigma-Aldrich	P6782	溶于纯水中。于-20°C保存，并避光。
鲁米诺	Sigma-Aldrich	A8511	溶于DMSO中。于-20°C保存，并避光。
Murashige和Skoog基础盐	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	4°C保存。
土壤	SunGrow Horticulture	Sunshine Mix #1	也可使用其他类型土壤种植拟南芥。装盆时与水混合使用。
SpectraMax Paradigm多功能微孔板读板仪（配备LUM模块）	Molecular Devices		任何能够检测化学发光的酶标仪均可用于本实验。
白色聚苯乙烯96孔板	Fisher Scientific	07-200-589