测量免疫诱导的幼苗生长抑制

摘要

来源：Bredow, M. 等., 模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥. J. Vis. Exp. (147),(2019).

本视频展示了在 Arabidopsis thaliana 植物中进行的幼苗生长抑制实验。通过该实验测定免疫肽诱导子浓度增加对幼苗生长的影响。

方案

1. 幼苗生长抑制实验

1. 对种子进行灭菌处理，并播种于MS培养基平板上。
   1. 配制含有0.8%琼脂（w/v）的无菌半倍浓度（0.5x）MS培养基（2.16 g/L）。在超净工作台中将培养基倒入培养皿（90 × 15 mm）中。
   2. 在微量离心管中取约100粒种子，加入1 mL 70%乙醇振荡洗涤2分钟，随后吸弃乙醇。加入1 mL 40%次氯酸钠溶液，室温下轻柔摇动17分钟。吸除次氯酸钠溶液后，用1 mL无菌水清洗三次，每次5分钟。最后将种子重悬于1 mL无菌0.1%琼脂溶液中。
      注意：也可采用氯气气体法对种子进行灭菌处理24。
   3. 在超净工作台中，使用移液器将每种基因型约100粒种子播种于MS琼脂平板上，并用微孔胶带密封。
      注意：避免种子之间距离过近，以免后续幼苗移栽困难。
   4. 将平板置于4 °C（避光）条件下进行3–4天的春化处理，以同步萌发（图1A）。
2. 将幼苗移栽至含有免疫诱导肽的48孔板中。
   1. 春化处理结束后，将平板转移至短日照条件下培养（22 °C，光照10小时，光照强度150 μE/m²/s，相对湿度65–70%），持续3–4天，以促进种子萌发。
   2. 在超净工作台中，用含1%蔗糖（w/v）的无菌0.5x MS液体培养基配制诱导肽的系列稀释液（0 nM、1 nM、10 nM、100 nM 和 1,000 nM），每块48孔板使用25 mL MS培养基。使用移液器向每个孔中加入500 µL MS液体培养基或含肽的MS培养基。如条件允许，可使用多通道重复移液器以加快操作速度。
      注意：每种基因型均需设置不含诱导肽的MS培养基对照组，以排除幼苗生长本身存在的固有差异。
   3. 使用无菌镊子小心地将大小和生长状态一致的单株幼苗移栽至各孔中，确保幼苗无损伤、根部无断裂，并完全浸没于培养基中。每种基因型在每种肽浓度下至少移栽6–8株幼苗（图1B）。
      注意：建议在萌发后第4天进行移栽，此时根较短，操作更方便；过晚移栽可能导致实验结果不理想。
   4. 用微孔胶带密封培养板，重新放回标准短日照条件（22 °C，光照10小时，光照强度150 μE/m²/s，相对湿度65–70%）下继续培养，使幼苗生长8–12天。

2. 确定生长抑制百分比。

1. 小心地从48孔板中取出幼苗，并用纸巾轻轻吸干。使用分析天平称量幼苗重量并记录数值。如有条件，可使用配备USB输出功能的分析天平，将鲜重数据直接记录到电子表格中。在称重前，先拍摄照片以直观展示生长抑制情况（图1C）。
2. 按下式计算诱导剂处理组幼苗相对于仅在MS培养基中生长的对照组幼苗的生长抑制率：
   
3. 使用带有标准误差条的柱状图或箱线图（box and whisker plot）绘制数据，以更清晰地展示实验间的变异情况。

结果

图 1. Arabidopsis 中诱导子诱导的幼苗生长抑制检测。（A）将幼苗播种于 MS 琼脂培养基上，在标准短日照条件下培养 3–4 天。（B）将幼苗移栽至含有 MS 培养基或含不同浓度 elf18 的 MS 培养基的 48 孔板中。（C）培养 8–12 天后，通过肉眼评估幼苗大小，然后使用分析天平测定鲜重，以计算生长抑制百分率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔无菌板（带盖）	Sigma-Aldrich	CLS3548
带防风罩的分析天平	VWR	VWR-225AC	生长抑制实验可使用任何标准分析天平，但具备直接计算机输出功能者更佳。
BioHit mLine 机械式12通道移液器（30–300 µL）	Sartorius	725240	可使用任意多通道移液器，必要时也可使用单通道移液器。
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	将10 mM储备液肽存于-80 °C低蛋白吸附管中。解冻后，将100 µM工作液存于-20 °C。
Murashige和Skoog基础盐	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	4 °C保存。
白色聚苯乙烯96孔板	Fisher Scientific	07-200-589