一种检测水稻组织免疫诱导后活性氧产生的测定方法

摘要

来源：Wang, Y., 等. 利用化学发光法实时检测水稻免疫反应中活性氧的产生. J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种在病原体相关分子模式（PAMP）诱导下，实时检测水稻组织中活性氧（ROS）产生的实验方法。将剪切的叶鞘段和叶片圆片暴露于一种来源于细菌鞭毛的肽段，该肽段作为PAMP发挥作用。当植物细胞上的模式识别受体（PRRs）识别该肽段后，会迅速引发短暂的ROS产生，该过程可被检测到 通过 化学发光检测

方案

注意：该方案适用于不同的植物组织。本方案中以水稻叶鞘和叶盘用于PAMP诱导后的ROS检测。由于差异主要源于取样方法的不同，以下仅描述通用步骤，必要时会注明具体操作步骤。

1. 组织制备与预处理

1. 水稻叶鞘
   1. 用锋利的剃须刀片或手术刀片将10日龄水稻幼苗的叶鞘切成3 mm长的片段，用于在活性氧（ROS）检测前1天进行预处理（图1B）。
   2. 将五个叶鞘片段放入含有100 µL双蒸水（ddH₂O）的96孔微孔板的单个孔中，在25 °C黑暗条件下孵育10–12小时，以使与机械损伤相关的离子渗漏和防御反应逐渐消退（图2）。
      注意：切割时应确保切口垂直，以保证各片段暴露于诱导溶液的切面面积一致，这是获得高度可重复结果的重要步骤。操作时应轻柔移动片段，避免在片段上造成额外切割或损伤，以免引起数据变异。原则上，每次实验至少应设置五个重复，因为ROS数值的变异较大。重复数量越多，数据越可靠。
2. 叶片圆片
   1. 使用带推杆的活检打孔器从4–6周龄的水稻植株上切取直径为4 mm的叶片圆片。为减少数据变异，应始终从主分蘖的第二片叶（从顶部数起）的中间三分之一区域取样（图1C）。
   2. 将一个叶片圆片放入含有100 µL ddH₂O的96孔微孔板的单个孔中，进行10–12小时的预处理，以使与切割损伤相关的反应消退，避免这些反应干扰PAMPs诱导的ROS产生（图2）。
      注意：操作叶片圆片时应轻柔，实验过程中不得对圆片进行额外切割或造成损伤，以防引起数据变异。ROS的诱导主要发生在切边的细胞中，因为水稻组织（叶片或叶鞘）表面覆盖有疏水层，只有切边的细胞能与诱导溶液接触（参见讨论部分）。
   3. 在微孔板的各孔中进行水相预处理时，应保持所有叶片圆片漂浮，且背面朝上，以避免因叶片正反面差异导致的实验变异。

2. 准备诱导溶液

1. 用 ddH₂O 将 L-012 粉末溶解配制成 20 mM（6.23 mg/mL）的水溶液，作为储备液。然后用 50 mM Tris HCl 缓冲液（pH 7.5）将储备液稀释，得到终浓度为 500 µM L-012 的工作液。储备液应保存于冷冻状态，使用前再稀释成工作液。
2. 配制含有 PAMP、L-012 和辣根过氧化物酶（HRP；10 mg/mL 溶于 ddH₂O）的诱导溶液。对于 10 mL 诱导溶液，混合 9.4 mL 的 50 mM Tris HCl（pH 7.5）溶液、400 µL L-012 溶液、100 µL HRP 和 100 µL flg22（PAMP；溶于 ddH₂O，终浓度为 10 mM）。作为阴性对照，用 100 µL ddH₂O 替代 PAMP。
   注意：配制好的诱导溶液应置于室温保存，以避免对水稻组织造成冷应激。根据需要也可使用其他 PAMP 进行处理，例如几丁质（终浓度为 20 ng/mL）。由于 L-012 对光敏感，所有含有 L-012 溶液的管子均需用铝箔包裹避光。

3. 启动软件并使用参考的微孔板读板仪设置实验方案（参见材料表）

注意：设置微孔板读数仪软件参数需要一定时间。建议在添加诱导溶液前，提前准备好仪器和程序（可一键启动）。

1. 启动软件。点击 实验 按钮以创建新方案或使用现有方案。
2. 在弹出窗口中点击 步骤 以设置酶标板。从板中选择需要监测的孔。
3. 点击 开始动力学检测 以设置总 运行时间 和 读数间隔。根据实验需求将 运行时间 设置为 35 分钟或更长。如需尽可能频繁地获取读数，请选择 最短间隔。积分时间根据信号强度选择 1 秒或更长。
   注意：读数间隔取决于样品数量和信号积分持续时间。
4. 点击 验证 | 确定 以确认设置。
5. 在弹出窗口中点击 检测新板，并等待软件提示加载板对话框。将待测板放置在载板架上。
6. 在此暂停，等待诱导系统建立（见下一节）。一旦诱导系统准备就绪，立即点击 运行 以开始读数。

4. 建立诱导系统并测量实时活性氧产生

1. 小心移除含有预处理组织的孔中 ddH₂O，避免造成组织损伤或干燥。
2. 使用多通道移液器向含有组织的孔中加入 200 µL 诱导溶液。
3. 轻轻振荡混匀。点击 运行 开始检测。
   注意：经 PAMP 处理后，植物组织会迅速响应并产生活性氧（ROS）。因此，建议先处理不含 PAMP 的阴性对照，以缩短多个处理操作之间的时间。应尽可能快速操作，以减少不同处理间的诱导延迟。从加入诱导溶液到开始检测之间的时间越短，越有利于捕获重要的实验数据。

结果

图 1：用于叶鞘取样的水稻幼苗生长条件与发育阶段，以及实验中所用的水稻叶鞘和叶片部位示意图。（A）水稻种子在无菌条件下于 1/2 MS 培养基中培养 10 天，可用于活性氧（ROS）检测取样。无菌处理的水稻种子接种于 1/2 MS 培养基，在透明玻璃试管中培养，培养条件为 12 小时光照/12 小时黑暗光周期，试管直径为 8.5 cm，高度为 15 cm。（B）叶鞘取样部位示意图。叶鞘取自培养 10 天的水稻幼苗，位于根部上方、第一片叶下方。（C）叶圆片取样位置示意图。叶圆片可从健康水稻植株主茎的第二片叶（从顶部计数）的中部三分之一区域切取，适用于任意生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔微孔板	WHB	WHB-96-01
flg22	生工生物	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		软件
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]吡啶嗪-1,4-二酮，CAS #:143556-24-5
酶标仪	BioTek	Synergy 2
辣根过氧化物酶（HRP）	Sigma	P8375
取样器	Miltex	15110-40
Tris	生工生物	A610195