一种用于研究单核细胞单层中 Fcγ 受体介导吞噬作用的检测方法

摘要

来源：Tong, T. N., 等. 利用单核细胞单层法评估 Fcγ 受体介导的吞噬作用. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用外周血来源的原代单核细胞进行单核细胞单层实验的方法，用于评估Fcγ受体介导的吞噬作用，其中使用多聚D抗体包被的R₂R₂型红细胞作为靶细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 外周血单个核细胞的分离

1. 通过静脉穿刺，使用含有酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）抗凝剂的真空采血管（黄帽管）从健康供体或患者获取人全血。
   注意：全血可在 ACD 中于室温（18–22 °C）保存最长 36 小时，之后再进行下一步操作。通常，1–2 支 10 mL 的真空采血管采集的全血足以满足本实验需求。
2. 将全血用预热的完全 RPMI 培养基（RPMI-1640，添加 10% 胎牛血清、20 mM HEPES 和 0.01 mg/mL 庆大霉素）按 1:1 体积比稀释。
3. 按照制造商推荐的方法（参见材料列表），通过密度梯度离心法从稀释后的全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。将稀释后的血液缓慢地层加在密度梯度液上（密度梯度液预先平衡至室温，18–22 °C）。
   注意：为获得最佳的血液分离效果，应尽量减少两相界面处的混合，可通过逐滴缓慢加样或使用移液器小心操作实现。
   1. 将移液管尖端靠近密度梯度液表面，并使血液混合物沿管壁缓慢流下，从而实现血液混合物在密度梯度液上方的缓慢分层。
   2. 根据实验规模，在 15 mL 离心管中将 10 mL 血液混合物加至 3 mL 密度梯度液上方，或在 50 mL 离心管中将 35 mL 血液混合物加至 15 mL 密度梯度液上方。通常情况下，10 mL 全血可获得约 1000 万个 PBMCs，但不同供体之间存在一定差异。
      注意：必须确保血液混合物与密度梯度液之间不发生混合。血液混合物应完整地覆盖在密度梯度液上方，并缓慢上升，直至所有血液均位于密度梯度液之上。
   3. 将分层后的混合物以 700 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。离心后混合物应分为五层（从上至下）：血浆层、白膜层（含 PBMCs）、密度梯度介质层、粒细胞层和红细胞层。
   4. 用巴斯德移液管和吸球移除并弃去大部分血浆，小心收集白膜层（PBMCs）至新的 15 mL 离心管中。
      注意：收集白膜层时，可将移液管尖端紧贴管壁，在该层外围做环形移动，同时施加轻微负压，以高效回收细胞。
4. 将分离得到的 PBMCs 用 pH 7.3 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，每次洗涤之间以 350 × g 离心 10 分钟（启用全刹车）。将 PBMC 沉淀重悬于完全 RPMI 培养基中。根据沉淀体积大小，加入 3–7 mL 培养基即可。
5. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对 PBMCs 进行计数。仅计数未被台盼蓝染色的活细胞。将 PBMCs 重悬于完全 RPMI 培养基中，调整细胞浓度至 1,750,000 个细胞/mL。
6. 将 400 µL 细胞悬液（含 700,000 个细胞）接种至 8 孔载玻片的每个孔中。将载玻片置于 37 °C、完全湿润的组织培养箱中（含 5% CO₂）孵育 1 小时，使单核细胞/巨噬细胞充分贴壁。

2. 贴壁单核细胞的预处理

注意：仅当寻找抑制或增强吞噬作用的方法时，此步骤才必要。

1. 使用完全 RPMI 培养基将感兴趣的药物或其他测试物质重悬至所需浓度，对贴壁的单核细胞进行预处理。
   注意：例如，当使用人单核细胞时，通常使用 200 µg/mL 的静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）可实现 95–100% 的吞噬作用抑制。
2. 在 8 孔载玻片中孵育 1 小时后（步骤 1.6 之后），吸除并弃去含有未贴壁细胞的上清液。加入 400 µL 药物或其他处理液，在 37 °C 下孵育 1 小时。
   1. 在对 8 孔载玻片进行液体吸除和更换时，应控制液体流速，防止弱贴壁细胞脱落。同时，每次仅处理 2–3 个空孔，避免孔内干燥。
      注意：通常每种处理均设置技术重复三孔。

3. R₂R₂ 红细胞的调理作用

注意：经调理的 R₂R₂ 红细胞用作 FcγR 介导的吞噬作用的阳性对照。未致敏的 R₂R₂ 红细胞应保存于自制的阿氏液（Alsever's solution）中（以延长保存期限），于 4 °C 保存不超过 1 个月。阿氏液由以下成分组成（均为质量体积比）：0.8% w/v 枸橼酸三钠（二水合物）、1.9% w/v 葡萄糖、0.42% w/v 氯化钠和 0.05% w/v 枸橼酸（一水合物）。若无法获得 R₂R₂ 红细胞，也可使用其他 Rh 表型红细胞，如 R₁R₂、R₁R₁、R₁r 或 R₂r。

1. 将 R₂R₂ (cDE/cDE) 红细胞用 PBS 洗涤，共洗涤三次，每次以 350 × g 离心 5 分钟。
   注意：所需红细胞的数量取决于实验规模，可进行反向计算。始终洗涤过量的红细胞，因为在每次洗涤过程中，由于溶血或去除上清液时的操作，红细胞会有损失。例如，在包含 5 个处理组和 2 个对照组、每组设三个技术重复的实验中，共需 21 个孔。每个孔加入 400 µL 含 1.25% 红细胞的混合液，则共需 105 µL 压积的、已调理的红细胞。因此，初始应洗涤 200 µL 红细胞，并对其中 150 µL 进行调理，以确保吞噬实验步骤中有足够的红细胞量。
2. 用体积比为 1:1 的人血清多克隆抗-D 抗体对洗涤后的 R₂R₂ 沉淀进行调理，并在 37 °C 下孵育 1 小时，期间间歇混匀。
   注意：若无法获得多克隆抗-D 抗体，可使用市售的单克隆抗-D 抗体，或从血库或输血服务机构获取常规用于 Rh 免疫预防的抗-D 抗体。在建立该检测方法之初，以及每次更换未标定效价的多克隆抗体批次或更换为单克隆抗体时，均应进行优化测试。目的是确定抗-D 抗体的最佳浓度或体积，使其在抗球蛋白试验（IAT）中产生 3+ 至 4+ 的凝集反应，并在吞噬实验中达到每计数 100 个单核细胞有 70–90 个红细胞被吞噬的结果。
3. 将调理后的 R₂R₂ 用 PBS 洗涤三次，每次以 350 × g 离心 5 分钟。
   注意：可通过间接抗球蛋白试验（IAT）验证 R₂R₂ 调理是否成功。简要步骤为：加入第二抗体（多克隆抗人抗体）以结合红细胞表面的初级调理抗体，通过血凝反应观察信号放大情况。详细的试剂厂商操作流程见补充材料文件。
4. 用完全 RPMI 培养基将洗涤后的 R₂R₂ 沉淀重悬至体积分数为 1.25%。
   注意：多余的已调理 R₂R₂ 可用 Alsever 溶液在 4 °C 下保存，最长可保存一周。

4. Fc 受体介导的吞噬作用

1. 从8孔载玻片中吸除药物或培养基上清液，加入400 µL的1.25% v/v R₂R₂ 混合物，37 °C孵育2小时。
2. 孵育2小时后，使用生产商提供的适配器移除小室。用吸水纸吸去多余的R₂R₂ 在纸巾上。确保玻片不干燥。
3. 用 PBS 填满一个 100 mL 烧杯。将载玻片缓慢前后移动（约 30–40 次）浸入 PBS 中并轻轻洗涤，以去除大部分未被吞噬的 R₂R₂.
4. 从 PBS 中取出载玻片，用纸巾轻轻吸去多余的 PBS，并将载玻片自然晾干。
5. 用100%甲醇固定空气干燥的载玻片45秒，随后将固定后的载玻片空气干燥。
   注意： 载玻片可采用另一种更适用于后续染色（如Grünwald-Giemsa染色21或Wright-Giemsa染色）的方法进行固定。
6. 使用自制的Elvanol封片剂（或其它市售封片剂）封片，并加盖盖玻片。
   注意： Elvanol 封片剂由 15% w/v 聚乙烯醇树脂和 30% v/v 甘油溶于 PBS 中组成。将混合物加热至树脂完全溶解且甘油均匀分散。该封片剂可用其他市售封片剂替代。
7. 让封片在室温下过夜干燥，然后再进行定量分析。

5. 吞噬作用的定量分析

1. 使用相差显微镜和40倍物镜，通过计数至少200个单核细胞及其内吞噬的R₂R₂数量，手动量化吞噬事件的数量。每只手使用一个计数器，同时记录单核细胞数量和被吞噬的R₂R₂数量。
2. 通过将被吞噬的R₂R₂数量除以单核细胞数量再乘以100，计算平均吞噬指数。数据以均值（平均吞噬指数）± 均值标准误（SEM）表示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	RPMI 1640	R8758
磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537
8孔载玻片	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) 红细胞			可商业获得（例如，http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ reagent-red-blood-cells）
人血清多克隆抗-D抗体	Gamma Biologics	DIN 02247724	可用市售单克隆抗-D抗体或Rh免疫球蛋白替代
100% 甲醇	Caledon	6700-1-42
盖玻片	VWR	48366 067