一种用于研究单核细胞单层中 Fcγ 受体介导吞噬作用的检测方法

摘要

来源：Tong, T. N., 等. 利用单核细胞单层法评估 Fcγ 受体介导的吞噬作用. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用外周血来源的原代单核细胞进行单核细胞单层实验的方法，用于评估Fcγ受体介导的吞噬作用，其中使用多聚D抗体包被的R₂R₂型红细胞作为靶细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 外周血单个核细胞的分离

1. 通过静脉穿刺，使用含有酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）抗凝剂的真空采血管（黄帽管）从健康供体或患者获取人全血。
   注意：全血可在 ACD 中于室温（18–22 °C）保存最长 36 小时，之后再进行下一步操作。通常，1–2 支 10 mL 的真空采血管采集的全血足以满足本实验需求。
2. 将全血用预热的完全 RPMI 培养基（RPMI-1640，添加 10% 胎牛血清、20 mM HEPES 和 0.01 mg/mL 庆大霉素）按 1:1 体积比稀释。
3. 按照制造商推荐的方法（参见材料列表），通过密度梯度离心法从稀释后的全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。将稀释后的血液缓慢地层加在密度梯度液上（密度梯度液预先平衡至室温，18–22 °C）。
   注意：为获得最佳的血液分离效果，应尽量减少两相界面处的混合，可通过逐滴缓慢加样或使用移液器小心操作实现。
   1. 将移液管尖端靠近密度梯度液表面，并使血液混合物沿管壁缓慢流下，从而实现血液混合物在密度梯度液上方的缓慢分层。
   2. 根据实验规模，在 15 mL 离心管中将 10 mL 血液混合物加至 3 mL 密....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	RPMI 1640	R8758
磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537
8孔载玻片	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) 红细胞			可商业获得（例如，http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ reagent-red-blood-cells）
人血清多克隆抗-D抗体	Gamma Biologics	DIN 02247724	可用市售单克隆抗-D抗体或Rh免疫球蛋白替代
100% 甲醇	Caledon	6700-1-42
盖玻片	VWR	48366 067