在混合T细胞群体中测量异体反应性

摘要

来源：Juvet, S. C. 等，利用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种通过观察混合T细胞群体与携带同种异体抗原的树突状细胞相互作用（导致免疫突触形成）来评估T细胞同种反应性的方法。利用差异染色，并通过流式细胞术对含有免疫突触的双细胞聚集体进行定量分析，可揭示T细胞的同种反应性。

方案

1. 准备所需的试剂和材料

1. 制备含有2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）（“洗涤缓冲液”）。制备含有0.1%非离子去污剂的PBS加2%胎牛血清（FCS）（“透化洗涤缓冲液”；参见材料表）。制备含有1.5%甲醛的PBS。
   注意：甲醛具有腐蚀性且可能致癌，操作时必须佩戴适当的个人防护装备。
2. 制备含有2% FBS和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS，用于磁性细胞分离（“MCS缓冲液”）。
3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制50 µg/mL鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素（Phalloidin-FITC）。在DMSO中配制1 mg/mL的核染料（例如，1 mg/mL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）或双苯并咪唑染料；参见材料表）。准备适用于目标细胞和成像流式细胞仪的荧光染料标记抗体。
4. 获取动物组织（例如，淋巴结和脾脏）作为T细胞来源，以及同种异体动物组织（例如，脾脏和骨髓）作为抗原呈递细胞或前体细胞的来源。
5. 准备细胞培养基（例如，含10% FBS的RPMI 1640培养基或DMEM培养基），并添加50 µM 2-巯基乙醇、青霉素和链霉素，并准备24孔和/或96孔细胞培养板。

2. 准备受体呈递细胞（APCs）

注意： 理论上，该方法可用于检测任何抗原提呈细胞（APC）群体。本实验中采用小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DC）作为抗原提呈细胞。目前已有多种培养此类细胞的方案，简要步骤如下。

1. 用 RPMI 1640 或 DMEM 培养基冲洗股骨和胫骨中的骨髓。
2. 将悬浮细胞通过 70-µm 细胞筛网，以去除小块骨组织和碎片。
3. 通过离心收集细胞，然后在室温下使用氯化铵缓冲液裂解红细胞 5 分钟。
4. 离心收集细胞（400 × g，5 分钟），并重悬细胞沉淀。
5. 用 5–10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，再重悬细胞沉淀。
6. 使用细胞分离柱富集造血前体细胞：用生物素标记的抗 CD3 抗体（5 µg/mL）、抗 B220 抗体（5 µg/mL）、抗 MHC II 类抗体（1 µg/mL）和抗 CD11b 抗体（5 µg/mL）对细胞进行标记。
7. 离心收集细胞（400 × g，5 分钟），并重悬细胞沉淀。
8. 在 4 °C 下，用抗生物素磁性微珠（见材料表）孵育细胞 10 分钟。
9. 洗涤并离心收集细胞（400 × g，5 分钟），然后将细胞重悬于 1 mL MCS 缓冲液中；随后将细胞上样至已用 3 mL MCS 缓冲液预平衡并置于磁铁上的大容量阳性选择（LS）磁性细胞分离柱中，去除标记细胞。用 3 mL MCS 缓冲液洗涤柱子 3 次，穿流液即为所需细胞。
10. 将穿柱后的细胞在含 2 ng/mL 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和 2 ng/mL 重组人转化生长因子 β1（TGFβ1）的 RPMI 1640 或 DMEM 培养基中培养 6 天。每 2 天更换一半培养基，补充含 2 ng/mL GM-CSF 和 TGFβ1 的新鲜完全培养基。
    注意：人 TGFβ1 在小鼠细胞中具有活性。本实验所用未成熟树突状细胞（DC）已获得相关数据。其他细胞（例如，B 细胞和成熟 DC）可能也适合作为抗原呈递细胞（APC），但尚未在此检测中验证。
11. 将 DC 冻存在含 90% 血清和 10% DMSO 的冻存液中，并储存在液氮中；使用当天复苏。使用前，用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞数量。在用于第 4 部分实验前，将细胞沉淀重悬于适当密度的培养基中（见步骤 4.1）。

3. 准备T细胞

1. 采用阴性筛选方法，以避免无意中向细胞传递激活或抑制信号。
   注意： 本示例中，CD4⁺ T 细胞已准备用于分析。
   1. 为从小鼠脾脏中制备 CD4⁺ T 细胞，使用注射器活塞将脾脏组织研磨通过 70-µm 细胞滤筛。用洗涤缓冲液冲洗滤筛。
   2. 通过离心（400 × g，5 分钟）沉淀悬浮细胞，然后在室温下用氯化铵缓冲液重悬沉淀物，裂解红细胞 5 分钟。
   3. 再次离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，并重悬沉淀物。
   4. 用 5–10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，重悬沉淀物。
   5. 使用生物素标记的抗体对 CD8、主要组织相容性复合体 II 类（MHC II，1 µg/mL）和 CD19（5 µg/mL）进行细胞染色。4 °C 下孵育 10 分钟。
   6. 用 10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，重悬沉淀物。
   7. 根据制造商说明书，将细胞与抗生物素磁性微珠（见材料表）孵育。
   8. 用 10 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，离心（400 × g，5 分钟）；重悬沉淀物。
   9. 将细胞重悬于 1 mL MCS 缓冲液中，并通过置于磁铁上的、预先加入 3 mL MCS 缓冲液的磁性细胞分离柱富集 CD4⁺ T 细胞。用 3 mL MCS 缓冲液洗涤柱子 3 次。穿流液中将含有富集的 T 细胞。
2. 通过标准流式细胞术，使用一部分阴性筛选后的细胞评估 T 细胞纯度。使用荧光染料标记的链霉亲和素偶联物（用于识别应被柱子去除的生物素标记细胞）以及一种或多种抗体识别目标 T 细胞群体（本例中为 CD4）；纯度 ≥85% 即可接受。
   1. 使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数 T 细胞（≥90% 的细胞活力可接受）。
      注意： MCS 缓冲液含有 EDTA，在进行检测前必须去除。为此，通过离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤。再次离心（400 × g，5 分钟）收集细胞，并以适当密度重悬于培养基中（见步骤 4.1）。

4. 共同孵育T细胞和DC细胞

1. 以2:1的T细胞与DC细胞比例，在24孔或96孔细胞培养板中接种T细胞和DC细胞。确保24孔板的终体积不超过500 µL，96孔板的终体积不超过50 µL。
   注意： 较小的体积可促进细胞间相互作用，并为后续的固定缓冲液留出空间。
   1. 根据经验调整精确的细胞数量，但作为一般性指导，使用 1 x 10⁶ T 细胞和 0.5 x 10⁶ 每孔（96孔板）树突状细胞数量。此数值应视为细胞数目的最低要求，因为细胞数量过少将导致免疫突触的计数困难。
      1. 为增加细胞数量，设置重复孔并合并 之后 第5步（固定）。
         注意： 设置重复孔时，建议先在所有孔中接种树突状细胞（DCs），然后再在所有孔中接种T细胞；这样可以最大限度地减少各孔之间孵育时间的差异。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板4小时₂ 大气。

5. 在培养板中固定细胞

1. 向每个孔中加入细胞培养体积3倍的含1.5%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育30分钟；在将细胞从培养板上移除之前必须先进行固定，以尽量减少细胞间相互作用的破坏。
2. 将培养板中的细胞转移至离心管中，用于后续的洗涤和染色。在此阶段，需额外保留部分细胞用于单染对照。除这些对照外，其余全部培养细胞均应使用抗体混合液进行染色（见步骤4.1.1）。

6. 染色细胞

1. 在 100 µL 洗涤缓冲液中加入所需荧光染料标记的抗体混合物，室温避光孵育 30 分钟，对细胞进行染色。
   注意： 抗体混合物包括 T 细胞特异性和 APC 特异性抗体。应根据成像流式细胞仪的配置选择荧光染料，以便能够区分各荧光信号。在本实验中，使用了蓝色荧光染料标记的 CD11b（5 µg/mL，参见材料表）和 APC 标记的 CD90.2（5 µg/mL）。
2. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。将细胞重悬于含有 FITC 标记鬼笔环肽（浓度为 0.05–0.5 µg/mL）的破膜/洗涤缓冲液中，室温避光孵育 30 分钟。
   注意： 对小鼠细胞而言，约 0.1 µg/mL 的 FITC 标记鬼笔环肽浓度效果良好，但最佳浓度可能因供应商、细胞类型和成像流式细胞仪的不同而有所差异。
3. 用 1 mL 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。将细胞重悬于含有适当浓度核染料的破膜/洗涤缓冲液中（例如，约 25 µg/mL 的 7-AAD），室温避光孵育 30 分钟。
4. 用 1 mL 破膜/洗涤缓冲液洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。再用洗涤缓冲液洗涤一次，离心收集细胞沉淀，重悬于 50–100 µL 洗涤缓冲液中，并转移至带盖的小型微量离心管中。
5. 立即进行数据采集，或在 4 °C 避光保存数天后再进行成像流式细胞仪检测。
   注意： 此方法已成功用于细胞保存长达 7 天。更长时间的保存可能可行，但尚未经过测试。

7. 获取数据

1. 根据制造商的说明初始化并配置成像流式细胞仪。在采集任何数据之前，确保流动核心的稳定性。
2. 预留一个通道用于明场图像采集。在关闭明场通道的情况下，采集单染对照数据。
   1. 点击“Load”按钮，将含有完全染色样本（即已用所有必需荧光染料染色的样本）的试管插入支架中。
   2. 在“workspace”窗口中，选择并创建一个新的散点图，以长宽比（aspect ratio）对面积（area）作图，并圈选长宽比接近1的单细胞群体。为每个使用的通道创建一个新的散点图（通道强度位于横轴）。
   3. 针对每种荧光染料，检查阳性细胞群，如有需要，在“Illumination”框中调整激光电压。
   4. 卸下当前试管，加载第一个单染试管。
   5. 在“Acquisition Settings”框中输入样本名称，并设置应采集的事件数；若为单染样本（用于补偿对照），采集 1,000 - 2,000 个事件即可。
   6. 在“Channels”框中，选择每个样本所对应的染色通道。对于单染对照，应选择所有通道，但关闭明场和侧向散射通道。点击“Acquisition”框下的“Record”按钮；当事件数达到设定阈值时，采集将自动停止。
   7. 点击“Return”按钮卸下试管。对每个单染对照重复步骤 7.2.4 - 7.2.6。根据细胞仪型号及软件版本，在采集过程中可能无法设置 图1 中所示的全部门控（更精确的门控将在分析阶段进行；见第8节）。
3. 按照步骤 7.2 中单染样本的方式采集样本，但在“Channels”框中需选择所有必需通道，包括明场通道。
   1. 在记录数据前，检查各通道的荧光强度是否适合识别目标细胞群。若不合适，应调整激光设置，并按照步骤 7.2 的方法使用新设置重新采集单染对照数据。
   2. 对每个样本，采集数万个事件。
      注意：在大多数情况下，细胞间接触事件仅占总细胞数的极小部分（多数为单个细胞）。通常建议最终的膜接触门控中至少包含 100 个事件。

结果

图1. 用于鉴定同种反应性免疫突触的设门策略。A. 通过明场通道（通道4，Ch04）分析图像强度分布变化率的均方根（梯度RMS）来评估细胞图像，从而从所有事件中圈定在焦事件，具体方法如文中所述。B. 在在焦事件中，通过绘制明场通道的长宽比与面积关系图，将双联体与单个细胞区分开。单个细胞的长宽比接近1且面积较小，而双联体的长宽比接近0.5且面积较大。C. 随后绘制APC的荧光强度（本例中为树突状细胞[DC]标记物CD11c）与T细胞标记物（本例中为CD90.2）荧光强度的关系图，并圈定双阳性事件。可通过查看靠近设门边界的事件图像进一步优化设门边界。D.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	多种	视情况而定
乙二胺四乙酸，0.5 M 溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
非离子型去垢剂 Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635	溶液为 37% 甲醛，需稀释 25 倍以获得 1.5% 溶液
细胞筛，70 μm 孔径	Fisher Scientific	08-771-2
鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich	P5282
7-氨基放线菌素 D	Thermo Fisher Scientific	A1310	用 DMSO 重悬
别藻蓝蛋白偶联抗小鼠 CD90.2 抗体	eBioscience	17-0902
太平洋蓝偶联抗小鼠 CD11b 抗体	eBioscience	48-0112	太平洋蓝已被 eFluor 450 取代
生物素标记抗小鼠 CD3 抗体	eBioscience	13-0032
生物素标记抗小鼠 MHC II 类分子抗体	eBioscience	13-5321
生物素标记抗小鼠 B220 抗体	eBioscience	13-0452
生物素标记抗小鼠 CD8 抗体	eBioscience	13-0081
生物素标记抗小鼠 CD19 抗体	eBioscience	13-0193
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec	130-090-485
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MidiMACS 磁性细胞分选仪	Miltenyi Biotec	130-042-302
重组小鼠 GM-CSF	Peprotech	315-03
重组人 TGFβ1	Peprotech	100-21	人 TGFβ1 对小鼠细胞具有活性
Amnis ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	成像流式细胞仪；详情请见 http://www.emdmillipore.com/
IDEAS 软件	Amnis/EMD Millipore	N/A	免费下载（需注册）：https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
细胞培养基	多种	视情况而定
胎牛血清	多种	视情况而定
细胞培养板	多种	视情况而定