在混合T细胞群体中测量异体反应性

摘要

来源：Juvet, S. C. 等，利用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种通过观察混合T细胞群体与携带同种异体抗原的树突状细胞相互作用（导致免疫突触形成）来评估T细胞同种反应性的方法。利用差异染色，并通过流式细胞术对含有免疫突触的双细胞聚集体进行定量分析，可揭示T细胞的同种反应性。

方案

1. 准备所需的试剂和材料

1. 制备含有2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）（“洗涤缓冲液”）。制备含有0.1%非离子去污剂的PBS加2%胎牛血清（FCS）（“透化洗涤缓冲液”；参见材料表）。制备含有1.5%甲醛的PBS。
   注意：甲醛具有腐蚀性且可能致癌，操作时必须佩戴适当的个人防护装备。
2. 制备含有2% FBS和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS，用于磁性细胞分离（“MCS缓冲液”）。
3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制50 µg/mL鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素（Phalloidin-FITC）。在DMSO中配制1 mg/mL的核染料（例如，1 mg/mL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）或双苯并咪唑染料；参见材料表）。准备适用于目标细胞和成像流式细胞仪的荧光染料标记抗体。
4. 获取动物组织（例如，淋巴结和脾脏）作为T细胞来源，以及同种异体动物组织（例如，脾脏和骨髓）作为抗原呈递细胞或前体细胞的来源。
5. 准备细胞培养基（例如，含10% FBS的RPMI 1640培养基或DMEM培养基），并添加50 µM 2-巯基乙醇、青霉素和链霉素，并准备24孔和/或96孔细胞培养板。

2. 准备受体呈递细胞....

结果

图1. 用于鉴定同种反应性免疫突触的设门策略。A. 通过明场通道（通道4，Ch04）分析图像强度分布变化率的均方根（梯度RMS）来评估细胞图像，从而从所有事件中圈定在焦事件，具体方法如文中所述。B. 在在焦事件中，通过绘制明场通道的长宽比与面积关系图，将双联体与单个细胞区分开。单个细胞的长宽比接近1且面积较小，而双联体的长宽比接近0.5且面积较大。C. 随后绘制APC的荧光强度（本例中为树突状细胞[DC]标记物CD11c）与T细胞标记物（本例中为CD90.2）荧光强度的关系图，并圈定双阳性事件。可通过查看靠近设门边界的事件图像进一步优化设门边界。D.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	多种	视情况而定
乙二胺四乙酸，0.5 M 溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
非离子型去垢剂 Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635	溶液为 37% 甲醛，需稀释 25 倍以获得 1.5% 溶液
细胞筛，70 μm 孔径	Fisher Scientific	08-771-2
鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich	P5282
7-氨基放线菌素 D	Thermo Fisher Scientific	A1310	用 DMSO 重悬
别藻蓝蛋白偶联抗小鼠 CD90.2 抗体	eBioscience	17-0902
太平洋蓝偶联抗小鼠 CD11b 抗体	eBioscience	48-0112	太平洋蓝已被 eFluor 450 取代
生物素标记抗小鼠 CD3 抗体	eBioscience	13-0032
生物素标记抗小鼠 MHC II 类分子抗体	eBioscience	13-5321
生物素标记抗小鼠 B220 抗体	eBioscience	13-0452
生物素标记抗小鼠 CD8 抗体	eBioscience	13-0081
生物素标记抗小鼠 CD19 抗体	eBioscience	13-0193
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec	130-090-485
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MidiMACS 磁性细胞分选仪	Miltenyi Biotec	130-042-302
重组小鼠 GM-CSF	Peprotech	315-03
重组人 TGFβ1	Peprotech	100-21	人 TGFβ1 对小鼠细胞具有活性
Amnis ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	成像流式细胞仪；详情请见 http://www.emdmillipore.com/
IDEAS 软件	Amnis/EMD Millipore	N/A	免费下载（需注册）：https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
细胞培养基	多种	视情况而定
胎牛血清	多种	视情况而定
细胞培养板	多种	视情况而定