通过流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞

摘要

来源：Van Hoecke, L. 等，通过小鼠肺部支气管肺泡灌洗分析炎性细胞浸润。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了如何使用流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的多种免疫细胞。首先，利用活细胞染料识别单个免疫细胞，随后对表面标志蛋白进行差异化染色，从而实现对每种细胞类型的精确定量。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审核。

1. 准备

1. 灌洗液
   1. 配制含100 µM乙二胺四乙酸（EDTA）的平衡盐溶液。
      注意：为检测支气管肺泡灌洗（BAL）液中的蛋白质水平，建议添加蛋白酶抑制剂以防止BAL液中蛋白酶的活性。
2. 导管
   1. 通过将23 G针头插入透明聚乙烯21 G管（内径：0.58 mm，外径：0.965 mm，长度：0.5 cm）中制备导管。也可使用预制导管。
3. 麻醉剂
   1. 准备终末麻醉剂，优选可引起呼吸停止的麻醉剂（例如，磷酸盐缓冲液（PBS）中的戊巴比妥钠溶液（>100 mg/kg））。
      注意：建议使用注射麻醉而非吸入麻醉，因为吸入麻醉可能影响BAL液成分。例如，CO₂会影响血液pH值，进而影响不同化合物的重新分布。
4. 氯化铵-氯化钾（ACK）红细胞裂解缓冲液
   1. 通过将8.29 g氯化铵（NH₄Cl）和1 g碳酸氢钾（KHCO₃）溶于含100 µM EDTA的1 L H₂O中配制ACK裂解缓冲液；红细胞裂解缓冲液也可从外部供应商购买。

2. 支气管肺泡灌洗（BAL）的操作

1. 将导管插入气管
   1. 使用26 G针头经腹腔注射致死剂量的短效巴比妥类麻醉剂以处死小鼠。为确认已达到致死性麻醉效果，可用镊子夹捏小鼠后肢足部以检查足部反射。
   2. 将动物仰卧位放置于手术板上，并用大头针固定四肢。
   3. 用70%乙醇喷洒颈部进行消毒。使用手术刀在靠近气管的颈部皮肤处做一切口。
   4. 切开皮肤以暴露唾液腺。用镊子分离唾液腺，暴露胸骨舌骨肌。用镊子切开气管周围的肌肉以充分暴露气管。
   5. 用镊子将一根棉线从气管下方穿过。
   6. 使用26 G针头小心穿刺暴露的气管软骨环之间的中段部位。注意避免进一步损伤气管组织。
   7. 将导管插入气管约0.5 cm。确保导管插入深度适中，避免插入过深而损伤肺部结构。
   8. 利用步骤2.1.5中放置的棉线将气管连同导管一起结扎固定。若结扎不充分，注入的平衡盐溶液可能逆流至呼吸道上段，而非进入肺部。
2. 收集灌洗液
   1. 用1 mL注射器吸取1 mL含100 µM EDTA的无菌平衡盐溶液。
   2. 将1 mL注射器连接至导管，缓慢将盐溶液/EDTA注入肺内。
   3. 在轻柔按摩小鼠胸壁的同时回抽液体。若在注射器中未见回吸液体，可小心将导管在气管内略进或略退少许。
   4. 将注射器从针头取下，将回收的灌洗液转移至置于冰上的15 mL离心管中。通常情况下，每注入1 mL液体可回收700–900 µL的支气管肺泡灌洗液（BAL）。
   5. 重复步骤2.2.1–2.2.4共两次。
      注意：若目的是分析非细胞成分，当检测灵敏度受限时，建议对合并后的样本进行浓缩处理。

3. 收集支气管肺泡灌洗液中的细胞与非细胞成分

1. 将灌洗液在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 7 分钟。
2. 收集上清液，并立即用于后续分析（例如，酶联免疫吸附测定，ELISA），或于 -80 °C 冻存。保留细胞沉淀，用于分析肺部的细胞浸润情况。
3. 用 200 µL ACK 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
   注意：此步骤可确保红细胞裂解，同时保持白细胞完整。
4. 在室温下孵育 2 分钟。
   注意：为减少红细胞裂解带来的变异，此步骤时间不应超过 2 分钟。
5. 加入 1 mL 冷的 PBS 以稀释 ACK 裂解缓冲液。
6. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 7 分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于适量体积的 PBS 中，用于后续分析（见下文）。
   注意：PBS 的体积取决于将要进行的下游实验。

4. 通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液中的不同细胞类型

注意：一种可行的方法是通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BAL）中细胞的绝对数量和相对组成。本文旨在详细阐述BAL技术。流式细胞术本身是一种专门的技术，建议阅读有关该技术的专门文献。实验中使用与荧光染料偶联的抗体，这些抗体可识别特定细胞类型表面抗原（见表1）。通过设门策略，可在BAL细胞组分中鉴定T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。

1. 细胞表面染色
   注意： 必须包含流式细胞术分析所需的所有关键对照。需要三组试管（参见 表 2）：（1）含有样本的试管；（2）为每种抗体-荧光染料组合设置的支气管肺泡灌洗（BAL）细胞试管，用于制备单染样本，以确定流式细胞仪各通道的电压；（3）为每种抗体-荧光染料组合设置的微球试管，用于制备单染样本，以确定补偿矩阵。
   1. 在 PBS 中按适当稀释比例配制抗体与 Fc 封闭剂（抗 CD16/CD32）的混合液（参见 表 2必须在实验前确定每种抗体的最佳工作稀释度。
   2. 将细胞重悬于50 µL抗体混合液中（用于样品），并向关键对照组中加入50 µL适当稀释的抗体。
      注意： 染色可在96孔U形板中进行，这有助于显著减少染色液体积并同时处理大量样本。
   3. 在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   4. 400 x g 条件下离心 7 分钟 g 4 °C。弃去上清液。
   5. 用 PBS 重悬细胞，终体积为 200 µL。
      注意： 最终体积取决于流式细胞仪可获取的最小体积，不同仪器之间该数值可能略有差异。此外，读取体积还取决于样本在流式细胞仪中运行所需的细胞数量和/或时间。
   6. 使用样本和对照进行流式细胞术分析。
      注意： 为确定不同细胞群体的绝对细胞数量，应加入计数微球。在检测前，向每个样本中加入相同数量的微球（± 25,000 个微球）。通过前向散射和侧向散射，可利用流式细胞术识别计数微球（参见 图1随后，可通过比较微球事件与细胞事件的比例来计算样本中细胞的绝对数量。可使用以下公式：
      
2. 流式细胞术分析
   注意： 流式细胞术分析应在染色程序完成后立即进行。必须使用配备有适当激光器和滤光片以检测信号的流式细胞仪。 表3 概述了本手稿所述研究所需的激光器和滤光片。有关流式细胞术分析的更多信息，请参见 Adan 等.
   1. 根据前向散射和侧向散射设置初始门控，排除碎片和双联体（参见 图1).
   2. 使用单染细胞和微珠调整电压以及光谱重叠的补偿。
      注意： 这些设置因流式细胞仪型号而异，每次实验前均需进行检查。正确的流式分析依赖于前向散射光和侧向散射光的电压设置。恰当的前向散射和侧向散射信号有助于识别并确认待分析细胞的身份。为确定合适的电压值，应首先检测未染色的样本。
   3. 设置表面抗原的荧光门（参见 图1）并分析样品。

表1：免疫细胞表面抗原的选择。 本表列出了用于鉴定不同细胞类型的表面表位。需要多种标记物的组合才能可靠地定义特定的细胞类型。

抗原	细胞类型
分化簇3（CD3）	T细胞表面表达
分化簇11c（CD11c）	大多数树突状细胞高表达，但也存在于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及部分B细胞上。
分化簇11b（CD11b）	表达于多种白细胞表面，包括单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和巨噬细胞。
SiglecF	肺泡巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。
MHCII	通常仅存在于抗原呈递细胞上，如树突状细胞、单核吞噬细胞和B细胞。
CD19	B淋巴细胞抗原
Ly-6G	单核细胞、粒细胞和中性粒细胞的标志物

表2. 需包含的对照列表。 本表格列出了准确解读实验结果所需的所有必要对照。

样本
管	待加入细胞的抗原-荧光素标记物	抗体储存浓度 (mg/mL)	抗体稀释倍数	总体积 (µL)
	可固定活力染料	0.2	1/1000	50
	CD11c	0.2	1/800	50
	SiglecF	0.2	1/100	50
样本 X	MHCII	0.2	1/200	50
	CD3	0.2	1/200	50
	CD19	0.2	1/200	50
	CD11b	0.2	1/200	50
	Ly6G	0.2	1/200	50
电压对照
管	待加入细胞的抗原-荧光素标记物	抗体储存浓度 (mg/mL)	抗体稀释倍数	总体积 (µL)
未染色细胞	/	/	/	50
单染细胞	可固定活力染料	0.2	1/1000	50
单染细胞	CD11c	0.2	1/800	50
单染细胞	SiglecF	0.2	1/100	50
单染细胞	MHCII	0.2	1/200	50
单染细胞	CD3	0.2	1/200	50
单染细胞	CD19	0.2	1/200	50
单染细胞	CD11b	0.2	1/200	50
单染细胞	Ly6G	0.2	1/200	50
补偿对照
管	待加入微球的抗原-荧光素标记物	抗体储存浓度 (mg/mL)	抗体稀释倍数	总体积 (µL)
未染色微球	/	/	/	200
单染微球	CD11c	0.2	1/2000	200
单染微球	SiglecF	0.2	1/2000	200
单染微球	MHCII	0.2	1/200	200
单染微球	CD3	0.2	1/2000	200
单染微球	CD19	0.2	1/2000	200
单染微球	CD11b	0.2	1/400	200
单染微球	Ly6G	0.2	1/200	200

表3：本研究中所用流式细胞仪的激光器和滤光片概述。

激光类型	滤光片设置
	505 LP	525/50
蓝色 (488 nm)	550 LP	575/26
100 mW	670 LP	685/35
	750 LP	780/60
紫色 405 nm		450/50
100 mW
红色 633 nm		660/20
70 mW	750 LP	780/60

结果

图1：支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞流式细胞术检测的设门策略。 BAL细胞通过所述BAL方案分离获得。在小鼠气管内灌注脂多糖后24小时分离细胞。根据前向散射和侧向散射特性识别计数微球和细胞。在细胞设门中，通过前向散射和侧向散射识别单细胞。在此最后的细胞群体中，识别出活细胞。随后识别CD11c^high细胞和CD11c^low细胞。在CD11c^high群体中，分别根据MHCII和SiglecF的表达鉴定树突状细胞和巨噬细胞。在CD11c^low群体中，分别根据CD3ε和CD19的表达鉴定T细胞和B细胞。在剩余的细胞群...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	14175-129
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	E6511	有刺激性
23G × 1 1/4 针头	Henke Sass Wolf	4710006030	尺寸：0.60 × 30 mm
26G × 1/2 针头	Henke Sass Wolf	4710004512	尺寸：0.45 × 12 mm
塑料导管	BD 医疗技术	427411	聚乙烯导管，内径 0.58 mm (.023")，外径 0.965 mm (0.38")，30.5 m (100')
戊巴比妥钠	Kela NV	514
磷酸盐缓冲液	Lonza	BE17-516F	不含 Ca++、Mg++ 或酚红的 PBS；经无菌过滤
1 ml 注射器	Henke Sass Wolf	5010.200V0	无热原、无毒
镊子	Fine Science Tools GmbH	91197-00
手术剪	Fine Science Tools GmbH	91460-11
50 ml 离心管	TH.Geyer	7696705	无 RNase/DNase/内毒素
15 ml 离心管	TH.Geyer	7696702	无 RNase/DNase/内毒素
1.5 ml 微量离心管	Sigma-Aldrich	0030 120.094	聚丙烯
微量离心机	Sigma-Aldrich	5415R
离心机	Thermo Fisher Scientific	75004030
氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液	Lonza	10-548E	经无菌过滤
活/死细胞染色剂 - efluor506	ebioscience	65-0866-18	可固定的活力染料
CD11c-PE-cy7	eBiosciences	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biolegend	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiosciences	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biolegend	127621
绝对计数微球	Life Technologies Europe B.V.	C36950
抗-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
96 孔 340 µl 储存板	Falcon	353263	V 型底，天然聚丙烯
流式细胞仪	BD Biosciences
导管	BD Biosciences	393202