通过流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞

摘要

来源：Van Hoecke, L. 等，通过小鼠肺部支气管肺泡灌洗分析炎性细胞浸润。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了如何使用流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的多种免疫细胞。首先，利用活细胞染料识别单个免疫细胞，随后对表面标志蛋白进行差异化染色，从而实现对每种细胞类型的精确定量。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审核。

1. 准备

1. 灌洗液
   1. 配制含100 µM乙二胺四乙酸（EDTA）的平衡盐溶液。
      注意：为检测支气管肺泡灌洗（BAL）液中的蛋白质水平，建议添加蛋白酶抑制剂以防止BAL液中蛋白酶的活性。
2. 导管
   1. 通过将23 G针头插入透明聚乙烯21 G管（内径：0.58 mm，外径：0.965 mm，长度：0.5 cm）中制备导管。也可使用预制导管。
3. 麻醉剂
   1. 准备终末麻醉剂，优选可引起呼吸停止的麻醉剂（例如，磷酸盐缓冲液（PBS）中的戊巴比妥钠溶液（>100 mg/kg））。
      注意：建议使用注射麻醉而非吸入麻醉，因为吸入麻醉可能影响BAL液成分。例如，CO₂会影响血液pH值，进而影响不同化合物的重新分布。
4. 氯化铵-氯化钾（ACK）红细胞裂解缓冲液
   1. 通过将8.29 g氯化铵（NH₄Cl）和1 g碳酸氢钾（KHCO₃）溶于含100 µM ....

结果

图1：支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞流式细胞术检测的设门策略。 BAL细胞通过所述BAL方案分离获得。在小鼠气管内灌注脂多糖后24小时分离细胞。根据前向散射和侧向散射特性识别计数微球和细胞。在细胞设门中，通过前向散射和侧向散射识别单细胞。在此最后的细胞群体中，识别出活细胞。随后识别CD11c^high细胞和CD11c^low细胞。在CD11c^high群体中，分别根据MHCII和SiglecF的表达鉴定树突状细胞和巨噬细胞。在CD11c^low群体中，分别根据CD3ε和CD19的表达鉴定T细胞和B细胞。在剩余的细胞群.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平衡盐溶液	Thermo Fisher Scientific	14175-129
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	E6511	有刺激性
23G × 1 1/4 针头	Henke Sass Wolf	4710006030	尺寸：0.60 × 30 mm
26G × 1/2 针头	Henke Sass Wolf	4710004512	尺寸：0.45 × 12 mm
塑料导管	BD 医疗技术	427411	聚乙烯导管，内径 0.58 mm (.023")，外径 0.965 mm (0.38")，30.5 m (100')
戊巴比妥钠	Kela NV	514
磷酸盐缓冲液	Lonza	BE17-516F	不含 Ca++、Mg++ 或酚红的 PBS；经无菌过滤
1 ml 注射器	Henke Sass Wolf	5010.200V0	无热原、无毒
镊子	Fine Science Tools GmbH	91197-00
手术剪	Fine Science Tools GmbH	91460-11
50 ml 离心管	TH.Geyer	7696705	无 RNase/DNase/内毒素
15 ml 离心管	TH.Geyer	7696702	无 RNase/DNase/内毒素
1.5 ml 微量离心管	Sigma-Aldrich	0030 120.094	聚丙烯
微量离心机	Sigma-Aldrich	5415R
离心机	Thermo Fisher Scientific	75004030
氯化铵-氯化钾 (ACK) 裂解缓冲液	Lonza	10-548E	经无菌过滤
活/死细胞染色剂 - efluor506	ebioscience	65-0866-18	可固定的活力染料
CD11c-PE-cy7	eBiosciences	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biolegend	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiosciences	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biolegend	127621
绝对计数微球	Life Technologies Europe B.V.	C36950
抗-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
96 孔 340 µl 储存板	Falcon	353263	V 型底，天然聚丙烯
流式细胞仪	BD Biosciences
导管	BD Biosciences	393202