一种使用活性炭琼脂刃天青检测法评估受试化合物对分枝杆菌活性的方法

摘要

来源：Gold, B. 等，活性炭琼脂刃天青半定量中通量分枝杆菌计数法的可视化展示。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了用于评估抗微生物化合物对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）活性的炭琼脂刃天青检测法（Charcoal Agar Resazurin Assay, CARA）。CARA通过检测这些化合物对细菌生长的影响，并区分其杀菌作用与抑菌作用，从而帮助评估这些化合物的有效性。

方案

1. 建立复制型与非复制型 MIC₉₀ 检测方法

1. 接种 M. tuberculosis, M. bovis BCG 或 M. smegmatis 在 OD₅₈₀ 0.01–0.1 并扩增至对数中期（OD₅₈₀ ~0.5) 的 Middlebrook 7H9-ADN（含 0.2% 甘油、0.2% 右旋糖、0.5% 白蛋白和 0.085% NaCl 的 Middlebrook 7H9 培养基）或 7H9-OADC（含 0.2% 甘油和 10% OADC 补充剂的 Middlebrook 7H9 培养基）中。
2. 培养 M. tuberculosis 和 M. bovis 在细胞培养瓶中将BCG作为约20 ml静置培养物培养 M. smegmatis 在聚丙烯圆底（4 ml 培养）或 50 ml 圆锥形离心管（10–20 ml 培养）中振荡培养。将致病性分枝杆菌在 37 °C、20% O₂ 条件下孵育₂ 和 5% CO₂，和 M. smegmatis 在37 °C、20% O₂条件下₂.
3. 在复制和非复制条件下进行最小抑菌浓度（MIC90）类型的实验图1).
   注意： 测试试剂通常以复孔或四孔重复进行检测，以便每块96孔微孔板分别检测4种或2种化合物。例如，在一块96孔板中，一种测试试剂可设于A至D行，另一种设于E至H行。DMSO（溶剂对照）位于第1、2和12列，测试试剂的浓度梯度从第3列（最低浓度）至第11列（最高浓度）依次递增。MIC90样式的检测通常采用2倍稀释系列。目前已有多种适用于分枝杆菌的非复制模型，为便于说明，我们采用一种多重应激诱导的非复制模型。
   1. 对于复制测定实验，将200 μl处于7H9-ADN培养基中的细胞按OD值分配₅₈₀ 向透明底、组织培养处理的96孔板的所有孔中各加入0.01。
   2. 对于非复制性实验，用含有0.02% tyloxapol的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并将细胞重悬于非复制性培养基（0.05% KH₂PO₄，0.05% MgSO₄₄，0.005% 柠檬酸铁铵，0.0001% ZnCl₂₂，0.1% NH₄Cl，0.5% BSA，0.085% NaCl，0.02% tyloxapol，0.05% butyrate；用2 N NaOH调节pH至5.0。
      1. 将细胞稀释至 OD₅₈₀ 在非复制培养基中，将 NaNO₃ 调至 0.1 的浓度₂ 从新配制的 1 M 储液中稀释至终浓度为 0.5 mM。
      2. 将200 μl细胞按OD值分配₅₈₀ 将0.1加入经组织培养处理的透明底96孔板的所有孔中。
         注意： 将化合物稀释液配制成DMSO中的100倍浓缩储备液。因此，若在MIC板中测试某分子在终浓度为0.4–100 μg/ml范围内的作用，则需配制其在DMSO中的储备液浓度为0.04–10 mg/ml。
   3. 将测试剂1的稀释液2 μl加入A-E行，将测试剂2的稀释液2 μl加入E-H行。充分混匀。
   4. 向对照孔（通常为DMSO）加入2 μl溶剂对照，即第1、2、12列（A-H行）。充分混匀。
   5. 每次实验均应包含至少一个阳性对照，例如利福平，浓度为 0.004 至 1 μg/ml（用于复制型实验）和/或 0.08 至 20 μg/ml（用于非复制型实验）。
      注意： 建议使用 6-bromo-1H-indazol-3-amine9 作为对照化合物，浓度范围为 0.1 至 25 μg/ml，该化合物在非复制性多应激模型中具有选择性且依赖 NaNO2 的活性。
   6. 对于重复实验，将微孔板在 37 °C、20% O₂ 条件下孵育₂ 和5% CO₂ 7天（M. tuberculosis 和 M. bovis BCG）或 1-48 小时（M. smegmatis）。对于非复制型多重应激模型，在37 °C、1% O₂条件下孵育微孔板7天₂ 和5% CO₂₂ (M. tuberculosis 和 M. bovis BCG

2. CARA 微孔板的接种

1. 在需要使用 CARA 作为检测读数的时间点，使用设置为 50–75 μl 的多通道移液器小心重悬 MIC90 样式测定板各孔中的内容物。上下吹打至少 5–10 次，并用移液器吸头以圆周运动轻轻混匀孔内物质。
2. 将 10 μl 测定孔内容物转移至 CARA 微孔板。确保测定板上各孔内容物的排列顺序与 CARA 微孔板上一致。转移过程中避免飞溅，并确保将 10 μl 液滴准确点样至 CARA 微孔板各孔中央。确认 10 μl 液滴已被 CARA 微孔板完全吸收。
   注意：在将细胞点样至 CARA 微孔板前，无需进行任何稀释。
3. 用封板膜将多块 CARA 微孔板叠放后密封，然后将其放入可重复封口的塑料袋中。将 CARA 微孔板置于 37 °C 条件下孵育，氧气浓度为 20% O₂（用于 M. smegmatis）或 1% O₂ 和 5% CO₂（用于 M. tuberculosis 和 M. bovis BCG）。
4. 对于 M. tuberculosis 和 M. bovis BCG 的复制型检测：孵育 7 天；对于 M. tuberculosis 和 M. bovis BCG 的非复制型检测：孵育 10 天；对于 M. smegmatis 的复制型检测：孵育 1–2 天；对于 M. smegmatis 的非复制型检测：孵育 2–3 天。
   注意：上述时间为估计值，可根据不同的复制型、非复制型及应激条件进行相应调整。

3. 开发 CARA 微孔板

1. 当阴性对照孔（溶剂对照孔）中出现细菌生长的菌膜或更大、肉眼可见的菌落时，开始显色 CARA 微孔板。
   注意： 长时间培养后，CARA 微孔板的孔常会显得干燥，建议用无菌 PBS 预先润湿孔内内容物。这可以防止活性炭吸附刃天青，从而避免荧光信号偏低或孔间差异增大。
2. 使用多通道移液器配合一组 12 个 p200 吸头，沿孔壁加入 40 µl 无菌 PBS，并让 PBS 自然扩散至琼脂/细菌微菌落表面。
3. 通过将 5 mg 刃天青（终浓度 0.01%）与 50 ml PBS 中的 5% Tween-80 混合，配制 CARA 显色试剂。涡旋混匀后进行无菌过滤。
   注意： 也可将市售的刃天青液体溶液与含 10% Tween-80 的 PBS 按 1:1（v/v）比例混合，作为替代的 CARA 显色试剂。
4. 使用 12 通道移液器，向 CARA 微孔板的每孔加入 50 µl 新鲜配制的 CARA 显色试剂。轻轻前后摇动微孔板数次，以帮助试剂均匀分布至各孔的琼脂和细菌层表面。
5. 将微孔板放入可密封的塑料袋中，在 37 °C 下孵育至少 30 分钟（用于 M. smegmatis）或 45–60 分钟（用于 M. tuberculosis 或 M. bovis BCG）。
   注意： 若溶剂对照孔在最初一小时内未变为粉红色，可重新密封并继续孵育更长时间。
6. 读取荧光前，将 CARA 微孔板置于生物安全柜中，室温下敞盖放置 15 分钟。若在生物安全柜外使用 BSL3 级分光光度计，需在微孔板表面贴上光学级 PCR 封膜，并用软纸巾轻轻按压封膜表面，确保密封严密。
7. 采用顶部读板模式，激发波长 530 nm，发射波长 590 nm，测定荧光强度。无需对微孔板进行空白校正。

结果

图1： 肉汤MIC₉₀试验与CARA的示意图及预期结果。MIC₉₀和CARA的结果展示了8种可能的活性。MIC₉₀微孔板孔位的颜色编码为白色（无生长）和棕色（有生长），CARA微孔板的颜色编码为黑色（无荧光）和粉色（还原型刃天青荧光）。数据为假设结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Middlebrook 7H9	Beckton Dickinson	271310
Middlebrook 7H11	Beckton Dickinson	298810
Middlebrook OADC	Beckton Dickinson	212351
BSA，热激	Roche	3118958001
活性炭	Sigma
PBS，Dulbecco's，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺	Life Technologies / Invitrogen	14190-144
Tween 80	Sigma	P8074
利福平	Sigma	R3501
6-溴-1H-吲唑-3-胺	Alfa Aesar	H34095
磷酸二氢钾	Sigma	P0662
七水合硫酸镁	Sigma	M1880
柠檬酸铁铵	Sigma	F5879
七水合硫酸锌	Sigma	Z0251
氯化铵	Sigma	A9434
丁酸，液体	Sigma	B103500
刃天青粉末	Sigma	R7017
氯化钠	J.T. Baker	4058-01
预配刃天青溶液	Invitrogen	DAL1100
分光光度计	Molecular Devices	M5
96孔组织培养处理微孔板	Corning	3595
试剂储液槽	VWR	89094-678
可密封塑料袋	VWR	395-94602
14 mL 聚丙烯圆底管	Corning	352059
50 mL 圆锥形离心管	Corning	352070
75 cm2 细胞培养瓶	Corning	431464U